Автореферат (Структура и функции сигнальных белков PII у одноклеточных зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilis)

Санкт-Петербургский государственный университетНа правах рукописиМИНАЕВАЕкатерина СергеевнаСТРУКТУРА И ФУНКЦИИ СИГНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ PIIУ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙCHLAMYDOMONAS REINHARDTII И CHLORELLA VARIABILIS03.02.03 – микробиологияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург2016Работа выполнена на кафедре микробиологии Федерального государственногобюджетного образовательного учреждения высшего образования «СанктПетербургский государственный университет»Научный руководитель:Ермилова Елена Викторовна,доктор биологических наук, профессорОфициальные оппоненты:Борхсениус Сергей Николаевич, доктор биологическихнаук, профессор, заведующий лабораторией структурнойорганизации генома ФГБУН Институт цитологииЛось Дмитрий Анатольевич, доктор биологическихнаук, профессор, заведующий лабораториеймолекулярных основ внутриклеточной регуляции ФГБУНИнститут Физиологии растений им. К.А.ТимирязеваВедущая организация:Федеральное государственное бюджетноеобразовательное учреждение высшего образования«Московский государственный университет им.

М.В.Ломоносова»Защита состоится «16» июня 2016 г. в «11.00 » на заседании диссертационногосовета ДМ212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций приСанкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, СанктПетербург, Университетская наб., д. 7/9, Биологический факультет, аудитория 133С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М.ГорькогоСанкт-Петербургского государственного университета и на сайте http://spbu.ru/.Автореферат разослан «______»_____________2016 г.Ученый секретарьдиссертационного советаЕ.И.

Шарова2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы. Одно из фундаментальных свойств микроорганизмовсостоит в их способности быстро адаптироваться к изменениям в окружающейсреде, что обеспечивается в значительной степени эффективной работой системрецепции, передачи и интеграции экзо- и эндогенных сигналов. У прокариот(бактерий и архей) особая роль в рецепции и передаче различных по природесигналов принадлежит двухкомпонентным регуляторным системам, вовлеченнымв регуляцию метаболизма при изменяющихся условиях среды (Ермилова, 2012).Наряду с двухкомпонентными регуляторными системами ключевые функции вкоординированной регуляции центральных метаболических процессов у бактерийвыполняют сигнальные белки семейства PII (Forchhammer, 2008).

Сигналы обуровнях углерода, азота и энергетическом статусе бактериальных клетокпреобразуются в различные конформационные состояния и модификации этихбелков (Commichau et al., 2006). В зависимости от конформационного состояниябелки PII взаимодействуют с разными белками-мишенями, большинство изкоторых выполняют или регулируют ключевые реакции в путях ассимиляцииазота (Ермилова, 2012).

Последние данные указывают на то, что PII-трансдукторымогут представлять одно из наиболее распространенных семейств сигнальныхбелков в природе (Sant’Anna et al., 2009). Учитывая их присутствие у архей,бактерий и высших растений, PII-белки представляют древнюю сигнальнуюсистему, которая сохранила консервативность в процессе эволюции длякоординации реакций ассимиляции азота в ответ на состояние метаболизма.Анализ структуры и функций PII-белков способствует решению фундаментальнойпроблемы биологии, связанной с выяснением механизмов, определяющих уразных по уровню организации организмов восприятие и реализацию клеткамиспецифических ответов на действующие сигналы, включая такие какприсутствие/отсутствие в среде тех или иных питательных субстратов.До начала наших исследований (Ermilova et al., 2013) не былохарактеризован ни один представитель белков из семейства PII уэукариотических микроорганизмов.

Последнее обстоятельство значительноограничивало существовавшие представления как о свойствах самих белков, так ио спектре процессов, относящихся к метаболизму азота, которые ониконтролируют у организмов в целом.Цель работы состояла в характеристике структуры и функций сигнальныхбелков из семейства РII у модельных представителей одноклеточных зеленыхводорослей Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilis.В связи с этим были сформулированы следующие задачи исследования:1. Провести биоинформационный анализ первичных последовательностей белковPII C.

reinhardtii и C. variabilis, определить их олигомерную структуру исубклеточную локализацию.2. С помощью метода ПЦР в режиме реального времени провести анализтранскрипции генов CrGLB1 и CvGLB1 в разных условиях роста C. reinhardtii и C.variabilis.33. Оценить возможность формирования комплексов PII-белков C. reinhardtii(CrPII) и C. variabilis (CvPII) с N-ацетил-L-глутаматкиназами (NAGK) ипроанализировать роль CrPII и CvPII в регуляции активности соответствующихNAGK.4.

Провести сравнительный анализ особенностей PII-контролируемой регуляцииN-ацетил-L-глутаматкиназ C. reinhardtii, C. variabilis и двух филогенетическиудаленных представителей высших растений – Physcomitrella patens и Oryzasativa.Научнаяновизнаисследования.Впервыедляпредставителейфотосинтезирующих эукариотических микроорганизмов, C. reinhardtii и C.variabilis, выявлены и охарактеризованы белки из консервативного семействасигнальных белков PII.

Показано, что зрелые белки CrPII и CvPII локализованы вхлоропластах и, как белки прокариот и высших растений, формируютгомотримеры. Нерешенным вопросом эволюции PII-белков эукариот, включаяпроанализированные нами белки одноклеточных зеленых водорослей, былопоявление в их структуре удлиненного С-конца, функциональное значениекоторого было неясно. Нами впервые показано, что дополнительный участок наС-конце, обозначенный нами как Q-петля, специфичен для эукариотических PIIбелков и формирует сайт для связывания глутамина. Установлено, чтовзаимодействие с глутамином индуцирует такую конформацию PII, в которойбелок может связывать и активировать ключевой фермент метаболизма азота, Nацетил-L-глутаматкиназу, обеспечивая тем самым контрольный механизмформирования орнитина, аргинина и запасания азота в целом.Теоретическая и практическая значимость.

Нами выявлен механизмвосприятия глутамина в хлоропластах зеленых водорослей и высших растений заисключением представителей сем. Brassicaceae. Выявление первого рецептораглутамина в хлоропластах открывает дополнительные перспективы для болееглубокого понимания метаболизма азота у фотосинтезирующих организмов.Нами впервые предложен референс-ген для Chlorella variabilis, что делаетвозможным проведение корректного анализа количественной экспрессии генов уданного микроорганизма.Полученные в работе генетические конструкции могут быть использованына практике широким кругом исследователей при работе с РII-регулируемымисистемами фотосинтезирующих эукариот.Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, могут бытьиспользованы в материалах курсов лекций, читаемых на биологическомфакультете СПбГУ («Экология микроорганизмов», «Регуляторные процессы убактерий», «Сигнальные системы растений», «Физиология растительнойклетки»).Основные положения, выносимые на защиту.

1. Одноклеточные зеленыеводоросли Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilis имеют сигнальные4белки из семейства PII, которые принадлежат к субсемейству GlnB. 2. PII-белкиC. reinhardtii и C. variabilis локализованы в хлоропластах, формируютгомотримеры и контролируют фермент N-ацетил-L-глутаматкиназу (NAGK),который регулирует синтез аргинина. 3.

PII-белки C. reinhardtii и C. variabilisсодержат дополнительный участок на С-конце, Q-петлю, с помощью которойсвязывают глутамин и регулируют активность NAGK по глутамин-зависимомумеханизму.Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на VIIСъезде Общества физиологов растений России «Физиология растений –фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (НижнийНовгород, 2011),на XV международной конференции по клеточной имолекулярной биологии Chlamydomonas (Потсдам, Германия, 2012), наВсероссийскойнаучнойконференциисмеждународнымучастием«Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва,2013), на VIII Съезде ОФР России и Всероссийской научной конференции«Растения в условиях глобальных и локальных природно-климатических иантропогенных воздействий» (Петрозаводск, 2015).По теме диссертации опубликовано 4 статьи в журналах из перечня ВАК РФи цитируемых в РИНЦ, Scopus, Web of Science.Объем и структура диссертационной работы.

Диссертация изложена на 123страницах, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственныхисследований, заключения, выводов, списка сокращений, списка литературы.Список литературы включает в себя 126 источников, в том числе 125 наиностранном языке. Диссертация иллюстрирована 2 таблицами и 37 рисунками.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериалы и методы исследованияШтаммы. В качестве объектов исследований использовали штаммыодноклеточных зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii СС-124(nit1agg1mt-), CF59 (lrg6), 6145с, 621 (mt+) и Chlorella variabilis NC64A.Условия культивирования.

Клетки С. reinhardtii выращивали на среде TAP(Gorman и Levine, 1965) синхронно в режиме культивирования 12 ч свет:12 чтемнота при 23°С. Культивирование C. variabilis проводили на среде MBBM (VanEtten et al., 1983; Nichols и Bold, 1965) или BBM (MBBM без азота), содержащейNH4Cl (25 мM), аргинин (2, 10 или 15 мM) или глутамин (2, 10 или 15 мM) вкачестве источника азота при постоянном освещении с покачиванием притемпературе 25°C. Количество клеток оценивали с использованием камерыГоряева.

Размеры клеток определи микроскопически (Leica TCS-SP5, Leica5Microsystems, Германия) с использованием программного обеспеченияLeicaApplication.Для получения прегамет (незрелых гамет) С. reinhardtii вегетативныеклетки переносили в среду TAP-N (без азота) в начале световой фазыкультивирования, и инкубировали 24 часа в темноте.