Автореферат (1145821), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Гаметы получали путемосвещения прегамет в течение 2 ч.Биохимические методы. Изоляцию хлоропластов из C. reinhardtii, предварительнообработанныхавтолизином,проводилиметодомградиентногоцентрифугирования в перколле как описано ранее (Klein et al., 1983).Концентрацию хлорофилла в культурах С. reinhardtii и C. variabilis определялиметодом экстракции пигментов в 80% ацетоне (Arnon, 1949). Активностьглутаминсинтетазы в экстрактах клеток одноклеточных зеленых водорослейоценивали спектрофотометрически (BioRad, США) при длине волны 540 нм сиспользованием колориметрического метода с арсенатом натрия (Shapiro иStadtman, 1970). Внутриклеточный свободный аргинин экстрагировали из клетоки измеряли спектрофотометрически при длине волны 500 нм по описанному ранееколориметрическому методу (Sakaguchi, 1950).Определение глутамата проводили с использованный энзиматическигометода, основанного на изменении поглощения при длине волны 340 нм врезультате восстановления НАД+ до НАДH в ходе дегидрогеназной реакцииокисления глутамата.Оценку уровней синтезируемых белков проводили методом Вестернблоттинга.
Концентрации тотального белка в пробах оценивали методом самидочерным (Popov et al., 1975). В работе использовались специфичныепервичные антитела к CrPII (Pineda Antikörper-Service, Берлин, Германия), αCGE1, HSP70B (любезно предоставлены проф. М. Шродой, Германия), NAB1 иAOX1 (Agrisera, Швеция). После гибридизации с вторичными антителамикролика, конъюгированными с пероксидазой хрена (Sigma, США) детекциюпероксидазной активности на рентгеновской пленке проводили с использованиемхемилюминисцентного субстрата (Roche, Германия).Активность очищенных рекомбинантных белков NAGK определяли всопряженных ферментативных реакциях: ATФ-зависимое фосфорилированиеNAG через пируваткиназу и лактатдегидрогеназу с последующим окислениемНАДН (Beez et al., 2009).
Фосфорилирование одной молекулы NAGпропорционально окислению одной молекулы НАДН, что регистрируется каклинейное уменьшение поглощения при длине волны 340 нм. Реакцияфиксировалась в течение 10 мин с использованием спектрофотометра SPECORD200 (Analytik Jena AG, Германия) при 340 нм. Каталитические параметрыферментов рассчитывали, используя программное обеспечение GraphPad Prism6.01 (GraphPad Software, США).Для определения олигомерного состояния белков PII и NAGK, а такжеанализа характера их взаимодействия был использован метод эксклюзионнойхроматографии (гель-фильтрации) на колонке Superdex 200 10/300 GL (Amersham6Biosciences, Германия) с использованием системы AKTA micro (GE HealthcareLifeSciences, Германия).
Профиль элюции белка (или смеси белков) фиксировалсяс помощью УФ-детекции при длине волны 280 нм и анализировался с помощьюпрограммного обеспечения UniCorn5 (GE Healthcare LifeSciences, Германия). Дляанализа действия молекул-эффекторов на формирование комплекса CvPIICvNAGK использовался кросс-линкинг с помощью глутарового альдегида.Молекулярно-биологические методы. Оценку уровней экспрессии геновпроводили с использованием метода ПЦР в режиме реального времени натермоциклере LightCycler (CFX96 Real-Time PCR Detection System, BioRad, США)с использованием SYBRGreenI в качестве флюоресцентного красителя.Выделение тотальной РНК проводили фенол-хлороформным методом сиспользованием реагента Trizol (Invitrogen, США).
Одноцепочечная кДНК былаполучена с использованием набора для обратной транскрипции (Revert Aid HMinus First Strand cDNA Synthesis Kit, ThermoScientific, США) на матрице РНК,предварительно обработанной ДНКазойI (ThermoScientific, США). Значение Ctопределялось как номер цикла, на котором флюоресцентный сигнал реакциипересекает базовую линию, с использованием программного обеспеченияCFXManager. Относительная экспрессия оценивалась по методу ΔΔCt.Секвенирование N-конца GLB1-гена C.
variabilis выполнялось cиспользованием сайт-специфической амплификации методом ПЦР (GonzálezBallester et al., 2005), основанной на конструировании праймеров, содержащих на3’-конце специфические последовательности, которые соответствуют сайтамрестрикции частощепящих ферментов. Продукты ПЦР-реакции визуализировалис помощью электрофореза в 1,5%-агарозном геле с использованием бромистогоэтидия, изолировали из агарозного геля с использованием набора для экстракцииДНК (QIAquick Gel Extraction kit, QIAGEN, Германия), полученные фрагментыклонировали в вектор для клонирования ПЦР-продуктов pAL-TA (Евроген,Россия). Секвенирование ДНК-фрагментов проводили с использованием наборадля секвенирования (BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit,LifeTechnologies, США) на автоматическом секвенаторе (модель 3500xL GeneticAnalyzer, LifeTechnologies, США) на базе ресурсного центра по развитиюмолекулярных и клеточных технологий Санкт-Петербургского государственногоуниверситета.РекомбинантныебелкиPIIсострептавидиновымтагомбезпоследовательностей транзитных пептидов C.
variabilis (StrepCvPII-tp),Physcomitrella patens (StrepPpPII-tp), Oryza sativa (StrepOsPII-tp) были получены сиспользованием синтетических генов с оптимизированным набором кодонов дляэкспрессии в E.coli (Geneart/LifeTechnologies, Германия; MWG Eurofins GmbH,Германия). Для клонирования в вектор pASK-IBA3plus (IBA GmbH, Германия)использовалсяизотермальныйметодсборкимножественныхпоследовательностей по Гибсону (Gibson et al., 2009).
Разработку методологииклонирования и дизайн праймеров для реакции Гибсона проводили сиспользованием программного обеспечения CloneManager-9. Полученные вектора7трансформировали в Е. coli RB9060 (Bueno et al., 1985). После индукциитранскрипциигеновангидротетрациклиномочисткусинтезированныхрекомбинантных PII-белков проводили с использованием метода аффиннойхроматографии на колонке с иммобилизованной Strep-tactin агарозой (IBA GmbH,Германия) (Heinrich et al., 2004). Рекомбинантные белки NAGK были получены сиспользованием аналогичной стратегии клонирования в вектор pET15b (Novagen,Германия).
Конструкции белков NAGKA. thaliana, C. reinhardtii, C. variabilis безтранзитных пептидов с тагами из шести гистидинов (His6CrNAGK-tp,His6CrNAGK-tp и His6CvPIINAGK-tp) трансфомировали в E.coli Rosetta (Novagen,Германия), индуцировали IPTG и проводили очистку рекомбинантных белковCvNAGK с использованием метода аффинной хроматографии на колонке симмобилизованной Ni-NTA агарозой (IBA GmbH, Германия) (Maheswaran et al.,2004).Биоинформационныйанализпоследовательностейпроводилисиспользованием базы данных NCBI и программного обеспечения ClustalW.Анализ сигнальных последовательностей проводили с использованием ChloroP1.1 и TargetP1.1 (Emanuelsson et al., 1999; 2007).РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕБиоинформационный анализ аминокислотных последовательностей PIIбелков Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilisPII-белки цианобактерий и растений принадлежат к субсемейству GlnB.
Вгеномах одноклеточных зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii иChlorella variabilis идентифицированы единичные ядерные гены GLB1,кодирующие GlnB-гомологи, последовательности которых идентичны на 65,7%. Вработебылпроведенбиоинформационныйанализаминокислотныхпоследовательностей белков CrPII и CvPII и выявлен высокий процентидентичности с первичной последовательностью белка GlnB E. coli, которыйсоставляет 48,5%.
Кроме того, высокая идентичность в пределах этого региона уCrPII и CvPII также была выявлена с последовательностями PII-белков высшихрастений и цианобактерий: Arabidopsis thaliana (53,5 % и 54,7%), Oryza sativaJaponica (40,3 % и 53,7%), Solanum lycopersicum (39,0 % и 53,7%), SynechococcusPCC 7942 (53,5 % и 53,9%), Synechocystis sp. PCC 6803 (52,0 % и 53,4%,соответственно).Нами установлено, что PII-белки C.
reinhardtii и C. variabilis содержатконсервативные консенсусные участки, соответствующие B, C и Т-петлям вбелках этого семейства других организмов (рисунок 1). Не менее важно, что вCrPII и CvPII выявлены и все необходимые сайты для связывания таких молекулэффекторов как АТФ и 2-оксоглутаровая кислота, которые определяют свойствабелков семейства PII у всех охарактеризованных ранее представителей.8Рисунок 1. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей PII-белков C.variabilis, C.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
