Главная » Просмотр файлов » Автореферат

Автореферат (1145821), страница 2

Файл №1145821 Автореферат (Структура и функции сигнальных белков PII у одноклеточных зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilis) 2 страницаАвтореферат (1145821) страница 22019-06-29СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Гаметы получали путемосвещения прегамет в течение 2 ч.Биохимические методы. Изоляцию хлоропластов из C. reinhardtii, предварительнообработанныхавтолизином,проводилиметодомградиентногоцентрифугирования в перколле как описано ранее (Klein et al., 1983).Концентрацию хлорофилла в культурах С. reinhardtii и C. variabilis определялиметодом экстракции пигментов в 80% ацетоне (Arnon, 1949). Активностьглутаминсинтетазы в экстрактах клеток одноклеточных зеленых водорослейоценивали спектрофотометрически (BioRad, США) при длине волны 540 нм сиспользованием колориметрического метода с арсенатом натрия (Shapiro иStadtman, 1970). Внутриклеточный свободный аргинин экстрагировали из клетоки измеряли спектрофотометрически при длине волны 500 нм по описанному ранееколориметрическому методу (Sakaguchi, 1950).Определение глутамата проводили с использованный энзиматическигометода, основанного на изменении поглощения при длине волны 340 нм врезультате восстановления НАД+ до НАДH в ходе дегидрогеназной реакцииокисления глутамата.Оценку уровней синтезируемых белков проводили методом Вестернблоттинга.

Концентрации тотального белка в пробах оценивали методом самидочерным (Popov et al., 1975). В работе использовались специфичныепервичные антитела к CrPII (Pineda Antikörper-Service, Берлин, Германия), αCGE1, HSP70B (любезно предоставлены проф. М. Шродой, Германия), NAB1 иAOX1 (Agrisera, Швеция). После гибридизации с вторичными антителамикролика, конъюгированными с пероксидазой хрена (Sigma, США) детекциюпероксидазной активности на рентгеновской пленке проводили с использованиемхемилюминисцентного субстрата (Roche, Германия).Активность очищенных рекомбинантных белков NAGK определяли всопряженных ферментативных реакциях: ATФ-зависимое фосфорилированиеNAG через пируваткиназу и лактатдегидрогеназу с последующим окислениемНАДН (Beez et al., 2009).

Фосфорилирование одной молекулы NAGпропорционально окислению одной молекулы НАДН, что регистрируется каклинейное уменьшение поглощения при длине волны 340 нм. Реакцияфиксировалась в течение 10 мин с использованием спектрофотометра SPECORD200 (Analytik Jena AG, Германия) при 340 нм. Каталитические параметрыферментов рассчитывали, используя программное обеспечение GraphPad Prism6.01 (GraphPad Software, США).Для определения олигомерного состояния белков PII и NAGK, а такжеанализа характера их взаимодействия был использован метод эксклюзионнойхроматографии (гель-фильтрации) на колонке Superdex 200 10/300 GL (Amersham6Biosciences, Германия) с использованием системы AKTA micro (GE HealthcareLifeSciences, Германия).

Профиль элюции белка (или смеси белков) фиксировалсяс помощью УФ-детекции при длине волны 280 нм и анализировался с помощьюпрограммного обеспечения UniCorn5 (GE Healthcare LifeSciences, Германия). Дляанализа действия молекул-эффекторов на формирование комплекса CvPIICvNAGK использовался кросс-линкинг с помощью глутарового альдегида.Молекулярно-биологические методы. Оценку уровней экспрессии геновпроводили с использованием метода ПЦР в режиме реального времени натермоциклере LightCycler (CFX96 Real-Time PCR Detection System, BioRad, США)с использованием SYBRGreenI в качестве флюоресцентного красителя.Выделение тотальной РНК проводили фенол-хлороформным методом сиспользованием реагента Trizol (Invitrogen, США).

Одноцепочечная кДНК былаполучена с использованием набора для обратной транскрипции (Revert Aid HMinus First Strand cDNA Synthesis Kit, ThermoScientific, США) на матрице РНК,предварительно обработанной ДНКазойI (ThermoScientific, США). Значение Ctопределялось как номер цикла, на котором флюоресцентный сигнал реакциипересекает базовую линию, с использованием программного обеспеченияCFXManager. Относительная экспрессия оценивалась по методу ΔΔCt.Секвенирование N-конца GLB1-гена C.

variabilis выполнялось cиспользованием сайт-специфической амплификации методом ПЦР (GonzálezBallester et al., 2005), основанной на конструировании праймеров, содержащих на3’-конце специфические последовательности, которые соответствуют сайтамрестрикции частощепящих ферментов. Продукты ПЦР-реакции визуализировалис помощью электрофореза в 1,5%-агарозном геле с использованием бромистогоэтидия, изолировали из агарозного геля с использованием набора для экстракцииДНК (QIAquick Gel Extraction kit, QIAGEN, Германия), полученные фрагментыклонировали в вектор для клонирования ПЦР-продуктов pAL-TA (Евроген,Россия). Секвенирование ДНК-фрагментов проводили с использованием наборадля секвенирования (BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit,LifeTechnologies, США) на автоматическом секвенаторе (модель 3500xL GeneticAnalyzer, LifeTechnologies, США) на базе ресурсного центра по развитиюмолекулярных и клеточных технологий Санкт-Петербургского государственногоуниверситета.РекомбинантныебелкиPIIсострептавидиновымтагомбезпоследовательностей транзитных пептидов C.

variabilis (StrepCvPII-tp),Physcomitrella patens (StrepPpPII-tp), Oryza sativa (StrepOsPII-tp) были получены сиспользованием синтетических генов с оптимизированным набором кодонов дляэкспрессии в E.coli (Geneart/LifeTechnologies, Германия; MWG Eurofins GmbH,Германия). Для клонирования в вектор pASK-IBA3plus (IBA GmbH, Германия)использовалсяизотермальныйметодсборкимножественныхпоследовательностей по Гибсону (Gibson et al., 2009).

Разработку методологииклонирования и дизайн праймеров для реакции Гибсона проводили сиспользованием программного обеспечения CloneManager-9. Полученные вектора7трансформировали в Е. coli RB9060 (Bueno et al., 1985). После индукциитранскрипциигеновангидротетрациклиномочисткусинтезированныхрекомбинантных PII-белков проводили с использованием метода аффиннойхроматографии на колонке с иммобилизованной Strep-tactin агарозой (IBA GmbH,Германия) (Heinrich et al., 2004). Рекомбинантные белки NAGK были получены сиспользованием аналогичной стратегии клонирования в вектор pET15b (Novagen,Германия).

Конструкции белков NAGKA. thaliana, C. reinhardtii, C. variabilis безтранзитных пептидов с тагами из шести гистидинов (His6CrNAGK-tp,His6CrNAGK-tp и His6CvPIINAGK-tp) трансфомировали в E.coli Rosetta (Novagen,Германия), индуцировали IPTG и проводили очистку рекомбинантных белковCvNAGK с использованием метода аффинной хроматографии на колонке симмобилизованной Ni-NTA агарозой (IBA GmbH, Германия) (Maheswaran et al.,2004).Биоинформационныйанализпоследовательностейпроводилисиспользованием базы данных NCBI и программного обеспечения ClustalW.Анализ сигнальных последовательностей проводили с использованием ChloroP1.1 и TargetP1.1 (Emanuelsson et al., 1999; 2007).РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕБиоинформационный анализ аминокислотных последовательностей PIIбелков Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilisPII-белки цианобактерий и растений принадлежат к субсемейству GlnB.

Вгеномах одноклеточных зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii иChlorella variabilis идентифицированы единичные ядерные гены GLB1,кодирующие GlnB-гомологи, последовательности которых идентичны на 65,7%. Вработебылпроведенбиоинформационныйанализаминокислотныхпоследовательностей белков CrPII и CvPII и выявлен высокий процентидентичности с первичной последовательностью белка GlnB E. coli, которыйсоставляет 48,5%.

Кроме того, высокая идентичность в пределах этого региона уCrPII и CvPII также была выявлена с последовательностями PII-белков высшихрастений и цианобактерий: Arabidopsis thaliana (53,5 % и 54,7%), Oryza sativaJaponica (40,3 % и 53,7%), Solanum lycopersicum (39,0 % и 53,7%), SynechococcusPCC 7942 (53,5 % и 53,9%), Synechocystis sp. PCC 6803 (52,0 % и 53,4%,соответственно).Нами установлено, что PII-белки C.

reinhardtii и C. variabilis содержатконсервативные консенсусные участки, соответствующие B, C и Т-петлям вбелках этого семейства других организмов (рисунок 1). Не менее важно, что вCrPII и CvPII выявлены и все необходимые сайты для связывания таких молекулэффекторов как АТФ и 2-оксоглутаровая кислота, которые определяют свойствабелков семейства PII у всех охарактеризованных ранее представителей.8Рисунок 1. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей PII-белков C.variabilis, C.

Характеристики

Список файлов диссертации

Структура и функции сигнальных белков PII у одноклеточных зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilis
Свежие статьи
Популярно сейчас
Почему делать на заказ в разы дороже, чем купить готовую учебную работу на СтудИзбе? Наши учебные работы продаются каждый год, тогда как большинство заказов выполняются с нуля. Найдите подходящий учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6390
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее