Автореферат (Структура и функции сигнальных белков PII у одноклеточных зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilis), страница 4

Однако в ходе нашегоисследования было выявлено, что белки CrPII и CvPII не снимали ингибированиефермента аргинином и были способны выполнять данную функцию только вприсутствии глутамина. Как видно из рисунка 5Б, добавление глутамина к CvPII,действительно, инициировало способность последнего повышать активностьингибированного аргинином CvNAGK. По нашим данным добавление CvPII и 15мМ глутамина к CvNAGK повышало IC50 аргинина для CvNAGK с 1,2 ± 0,05 мМдо 4,18 ± 0,35 мМ.

Поскольку наибольшая разница в активности CvNAGK вприсутствии или в отсутствии CvPII с глутамином наблюдалась при 2 мМаргинина (рисунок 5А), то именно эта концентрация аминокислотыиспользовалась для анализа зависимости ферментативной реакции отконцентрации глутамина (рисунок 5Б). Действительно, внесение глутаминаприводило к активации ингибированного аргинином CvNAGK в присутствииCvPII по концентрационно-зависимому механизму. Половина максимальнойэффективной концентрации (ЕС50) глутамина для активации NAGK с помощьюCvPII была определена как 6,5 ± 1,1 мМ. Этот ответ сходен с зависимой отглутамина активацией CrNAGK белком CrPII, где значение EC50 для глутаминасоставило 4.6 ± 2,4 мМ (Chellamuthu et al., 2014).Каталитические константы комплекса CvPII-CvNAGK, определенные вприсутствии 15 мМ глутамина, указывают на то, что CvPII способен повышать14максимальную скорость (Kcat 44,3 ± 1,05 с-1 по сравнению с 25,6 ± 4,78 с-1)реакции ингибированного арнинином NAGK и снижать Km для NAGприблизительно в 20,5 раз (4.5 ± 0.52 мМ по сравнению с 92,4 ± 23,7 мМ).

Этотэффект аналогичен тому, что показано для белков С. reinhardtii (Chellamuthu et al.,2014).Полученные данные показывают также, что 2-ОГ (рисунок 5В) снижаетактивность NAGK по концентрационно-зависимому механизму. Половинамаксимальной ингибирующей концентрации для деактивации NAGK (IC50)достигается при 0,23 ± 0,019 мM 2-ОГ. Эта концентрация отражает сродство CvPIIк эффектору 2-ОГ, которое, предположительно, отражает адаптацию сенсорногобелка PII к физиологически значимым внутриклеточным концентрациям этоймолекулы.

Примечательно, что полученное намизначение являетсяпромежуточным между значениями, определенными для A. thaliana AtNAGK(IC50 0,036 мM) и С. reinhardtii CrNAGK (IC50 1.2 мM) (Beez et al., 2009;Chellamuthu et al., 2014).Глутамин-зависимая регуляция белками PII активности NAGK растенийДо недавнего времени оставался открытым вопрос о роли удлиненного Сконцав последовательностях PII-белков эукариот. Данные кристаллографии белкаСrPII позволили выявить на С-конце небольшую петлю (Q-петлю) котораясвязывает молекулу глутамина, изменяя конформацию белка на активную, т.е.способную к взаимодействию с N-ацетил-L-глутаматкиназой (Chellamuthu et al.,2014).

Аналогичная аминокислотная последовательность была выявлена нами вбелке CvPII (рисунок 1). Более того, проведенный сравнительный анализаминокислотных последовательностей PII указывает на то, что Q-петляконсервативна и выявляется во всех белках семейства за исключением белковпредставителей сем. Brassicacea (к которым принадлежит A. thaliana), которыеимеют делецию в три аминокислоты в области Q-петли (рисунок 1).Следует особенно подчеркнуть, что ранее у A.

thaliana не было описановыявленного нами глутамин-зависимого контроля активности PII при еговзаимодействии с NAGK. Возник вопрос о распространенности этого глутаминзависимого механизма среди других растений. Для этой цели были полученырекомбинантные белки PII двух филогенетически удаленных растений – мхаPhyscomitrella patiens и риса Oryza sativa.В работе было показано, что, как и PII белки одноклеточных зеленыхводорослей, PpPII и OsPII способны активировать ингибированный аргининомAtNAGK только в присутствии глутамина, причем по зависимому отконцентрации механизму (рисунок 5Г). Эти данные указывают на то, чтовыявленная для одноклеточных зеленых водорослей способность белка PIIсвязывать глутамин широко распространена среди растений.

Исключениесоставляют лишь PII-белки представителей сем. Brassicaceae, что, по-видимому,связано с небольшой делецией в Q-петле.15ЗАКЛЮЧЕНИЕАнализ структуры и функций белков из семейства PII у одноклеточныхзеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilis позволилприйти к следующему заключению.Впервые для представителей фотосинтезирующих эукариотическихмикроорганизмов выявлены и охарактеризованы белки из консервативногосемейства сигнальных белков PII, которые демонстрируют высокую степеньидентичности с белками бактерий и растений.

Полученные результаты указываютна то, что белки CrPII и CvPII, кодируемые ядерными генами, локализованы вхлоропластах. В первичной последовательности изученных белков сохраняютсяконсервативные аминокислоты, необходимые как для связывания молекулэффекторов (АТФ, 2-ОГ), так и для формирования тримерных структур. Крометого, экспериментально полученные данные также подтверждают, что PII-белкиодноклеточных зеленых водорослей функционируют как тримеры.Экспрессия гена CrGLB1, кодирующего PII-белок Chlamydomonas,контролируется светом и отсутствием азота в среде, что не сопровождается,однако, значительными изменениями в уровнях самого белка. Установлено также,что транскрипция CrGLB1 не контролируется регуляторами гаметогенеза.Напротив, у Chlorella, экспрессия гена CvGLB1, как и у большинства изученныхранее генов субсемейства glnB, не зависит от присутствия источников азота всреде, а также не изменяется в зависимости от фазы роста культуры.

Полученныеданные позволили нам предложить ген CvGLB1 в качестве референс-гена дляизучения количественной экспрессии генов Chlorella.В ходе выполнения исследования нами был получен фактический материал,показывающий, что ключевой фермент биосинтеза аргинина – N-ацетил-Lглутаматкиназа (NAGK), активность которого у цианобактерий и высшихрастений контролируется PII, является также мишенью PII-белков одноклеточныхзеленых водорослей C. reinhardtii и C. variabilis. Анализ каталитическойактивности белков CrNAGK и CvNAGK позволяет говорить о сходныхферментативных возможностях, а имеющиеся отличия, вероятнее всего,отражают особенности метаболизма Chlamydomonas и Chlorella.Полученные данные подтверждают высказанную ранее гипотезу о том, чтоPII-зависимая регуляция NAGK консервативна у организмов с оксигенным типомфотосинтеза. Однако на примере одноклеточных зеленых водорослей впервыебыло показано, что для снятия ингибирующего действия аргинина на NAGK,белки PII фотосинтезирующих эукариот нуждаются в глутамине (рисунок 6).Наличие консервативной Q-петли на С-конце PII-белков высших растений, непринадлежащих к сем.

Brassicaceae, указывает на то, что глутаминовыйсигналинг может быть общей функциональной чертой PII растений. Для проверкиэтого предположения, нами были получены рекомбинантные белки PII двухфилогенетически удаленных представителей – Physcomitrella patens и Oryzasativa. Показано, что оба PII-белка контролировали NAGK по глутаминзависимому механизму.

Т.о, наши данные предполагают, что в эволюции16хлоропластов зеленых водорослей от цианобактериальных предков, появилсяновый механизм рецепции глутамина с помощью небольшого С-концевогоудлинения PII-сигнальных трансдукторов.Рисунок 6. Схема, показывающая PII-зависимый контроль биосинтеза аргинина по глутаминзависимому и глутамин-независимому механизму.ВЫВОДЫ1. Одноклеточные зеленые водоросли Chlamydomonas reinhardtii и Chlorellavariabilis содержат сигнальные белки, относящиеся к субсемейству GlnBPII-белков, которые кодируются у них единичными ядерными генамиCrGLB1 и CvGLB1; полная нуклеотидная последовательность последнегоопределена (GenBank: KJ524571) и состоит из шести интронов и семиэкзонов.2. Транскрипция CrGLB1 контролируется светом и отсутствием азота в среде ине регулируется в процессе гаметогенеза.

Транскрипция CvGLB1 не зависитот условий культивирования клеток; ген предложен в качестве первогореференс-гена для проведения ПЦР в реальном времени у C. variabilis.3. Функционально активные белки PII C. reinhardtii (CrPII) и C. variabilis(CvPII) локализованы в хлоропластах и, подобно белкам прокариот ивысших растений, образуют гомотримеры.4. N-ацетил-L-глутаматкиназа (NAGK) является мишенью для белков CrPII иCvPII, которые формируют комплекс с гексамером фермента иконтролируют его активность.5. Белки CrPII и CvPII регулируют активность NAGK по глутамин-зависимомумеханизму.17СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМДИССЕРТАЦИИСтатьи:1.

Ermilova, E. PII Signal transduction protein in Chlamydomonas reinhardtii:localization and expression pattern / Е. Ermilova, T. Lapina, Zh. Zalutskaya, E.Minaeva, O. Fokina, K. Forchhammer // Protist. – 2013. – Vol. 164. – P. 49-59.2. Chellamuthu, V.R. A widespread glutamine-sensing mechanism in the plant kingdom/ V.R. Chellamuthu, E. Ermilova, T.