Отзыв официального оппонента (Функциональная гетерогенность Na,K-АТФазы в скелетной мышце)

В Диссертационный совет Д 212.232.10 при ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет» Отзыв официального оппонента Тарасовой Олы и Сергеевны на диссертационную работу Кравцовой Виолетты Васильевны «Функциональном гетерогенность 1'1а,К-АТФазы в скелетной мышце», представленную на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.03.01 - Физиологии Актуальность проблемы. Диссертационная работа В.В.Кравцовой посвящена изучению механизмов функционирования Ха,К-АТФазы — фермента, который играет ключевую роль в поддержании ионного гомеостаза клеток скелетной мышцы. В скелетной мышце Иа,К-АТФаза экспрессируется в двух молекулярных формах (а1 и аэ), которые существенно различаются по локализации в клетке и функциональной принадлежности.

Несмотря на то, что Ха,К-АТФаза, в особенности ее пэ изоформа, яВляются предметОМ ннтенсиВИОГО исследования, многогранность ее клеточных функций ставит Все новые и нОВьге Важные Вопросы, котОрые требуют экспериментального исследования и теоретического осознания. Как показано в последние годы„кроме ион-транспортной роли Ма,К-АТФаза является рецептором эндОГенных щэдиотонических стерОИЛОВ и участвует ВО внутриклеточной сигнализации.

Благодаря взаимодействию с разнообразными белками и липидами клетки она является участником многих молекулярных ансамблей, регулирующих важнейшие клеточные функции в норме и при патологических изменениях в организме. В связи с этим актуальность изучения различных аспектов функционирования Ма,К-АТФазы в скелетной мышце, включая проблематику работы В.В.Кравцовой, не вызывает сомнений. Структура работы. Диссе1этационная 1эабота В.В.К1эавцовой ~зло~сна на 236 страницах и включает введение, обзор литературы, характеристику материалов и методов исследования, четыре главы результатов 1каждая них из снабжена обсуждением полу~е~н~х данных), обобщающе~о заключения и ~~~од~~.

Работу заве1эшает объемный список цитируемой литературы, он включает 416 наименований, из них 37 русскоязычных. Автореферат достаточно полно и корректно передает содержание диссертационной работы и оформлен надлежащим образом. Общаи характеристика работы. Работа В,В.Кравцовой является образцовым примером комплексного подхода к изучению фундаментальной физиологической проблемы. Несомненным достоинством работы является использование, широкого набора современных методик, среди которых как классические (микроэлектродная регистрация мембранного потенциала клеток, регистрация сократительной активности мышечных препаратов |п Мго), так и современные, требующие особых навыков и использования неординарного оборудования (конфокальная флуоресцентная микроскопия, пламенная фотометрия, количественная ПЦР и Вестерн блоттинг), В.В.Кравцовой удалось стать центром международного коллектива, включающего ведущих физиологов нашей страны, Дании и Швеции, В работе получен обширный массив приоритетных экспериментальных данных, тщательно выполнены контрольные эксперименты, проведена грамотная статистическая обработка результатов, а также достаточно полное их обсуждение.

Первая часть работы (наиболее интересная„на мой взгляд) представляет собой фундаментальное исследование роли изоформ Иа,К-АТФазы в фуйкцйоййрованйй койцевой пластйнкй. Ойа йсторйческй восходй* классическим экспериментам Бернарда Катца, открытию феномена неквантового высвобождения ацетил холин а в нервно-мышечном синапсе, которое обеспечивает накопление и деполяризующее влияние ацетилхолина в синаптической щели в условиях ингибирования ацетилхолиэкстеразы. Важным достижением В.В.Кравцовой является установление механизма действия некВантового ацетилхОлина в естественных для синапса услоВиях, т,е.

При работающей системе его энзиматической деградации. Впервые показано, что в низких концентрациях ацетилхолйн оказывает противоположное (гиперполярнзующее) влияние„что обусловлено активацией а2 изоформы Иа,КАТФазы путем ее белок-белкового взаимодействия с никотиновыми холинорецепторами концевой пластинки. В этой же части работы впервые проведен анализ роли липидного окружения и белков цитоскелета в специфической локализации и функциональной активности )ча,К-АТФазы в синапсе. Вторая часть работы посвящена изучению хронических эффектов никотина при разных способах применения — путем аппликации на мышцу, а также при системном (подкожном и пероральном) введении в организм.

В этой части работы показано, что никотин при длительном действии в низких концентрациях вызывает изменения электрогенной акгнвности Ха,К-АТФазы в скелетных мышцах крысы, причем в зависимости от способа применения более выраженным изменениям может подвергаться Определенная (а| или а2 йзоформа). Полученные здесь результаты обеспечивают понимание механизмов вредоносного влияния табакокурения, а также могут оказаться полезными для медицинской токсикологий. В третьей части работы В.В. Кравцовой изучены изоформ-специфические изменения Ха,К-АТФазы в постуральной мышце крысы при снижении уровня ее сократительной активности в модели гравитационной разгрузки.

На самом деле, затрагиваемая здесь проблема намного шире, поскольку полученные результаты мОжнО проецировать на мышцы людей, которые В результате заболеваний оказываются прикованными к постели илн же вынуждены ограничить уровень с~~ей д~игат~~ьной а~~~в~~~т~. В этой ~а~ной ~~~ти работы В.В.Кравцовой впервые показано, что двигательная разгрузка сопровождается быстрым снижением активности а~ изоформы Ха,К-АТФазы в области концевой пластинки, а также во внесннаптическом регионе, причем это связано со структурными изменениями концевой пластики, а также с генерализованными перестройками липидного бислоя. Наконец, в последней части работы затронута новая и акгуальная проблема взаимодействия Ха,К-АТФазы с эндогенными кардиотоническимн стероидами. Впервые показано положительное инотропное влияние уабанна н маринобуфагенина при применении этих лигандов в очень низких (физиологических) концентрациях, Публикации не результатам исследований.

Список работ, опубликованных по теме диссертации, поражает своим объемом и качеством. Он включает 25 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, включая такие авторитетные издания как Ашепсап Лагпа) оГ Рйуз1о)оду, Тпе Хоигпа1 оК Оепега1 Рбуз1о1ойу, Тйе Уопгпа1 оКВю1орса) Сйепиз~гу и др. Результаты диссертационной работы неоднократно обсуждались на ведущих российских и международных конференциях и симпозиумах. Замечании, Принципиальных замечаний к работе В.В.Кравцовой у меня не возникло.

В качестве пожеланий можно отметить следующие моменты. 1. На мой взгляд, при анализе результатов следует уделять более пристальное внимание функциональным особенностям объекта исследования. В данной работе объекгамн служили две мышцы — камбаловидная и диафрагма, которые существенно различаются по миозиновому фенотнну (камбаловидна почти исключительно состоит из медленных волокон 1 типа, а в диафрагме таких волокон меньше — около 40%). Как видно из полученных данных, мышечные волокна этих мышцы различаются по уровню мембранного потенциала (рис. 3,2) и электрогенному вкладу изоформ Ыа,К-АТФазы в синаптической области (рис.

3.4). Непонятно, связаны ли выявленные электрофизиологические различия с миозиновым фенотипом мышечных волокон. 2. При исследовании утомления камбаловидной мышцы после подшивания геля с никотином проводилась стимуляция короткими высокочастотными пачками импульсов (рис. 4.6). Такой режим сократительной активности нетипичен для этой мышцы (частота стимулов слишком высокая для медленных двигательных единиц).

3. При описании экспериментальных серий с хроническим применением никотина следовало бы привести более подробную характеристику моделей, включая изменение массы тела животных в течение эксперимента, массы мышц, объем потребляемой жидкости (при пероральном применении вещества). Вопросы. 1. Можно ли устранить различие в уровне мембранного потенциала между синаптическим и внесинаптическим регионами путем фармакологического подавления не квантового высвобождения ацетилхолина, например, с применением гемихолиния 1МЙоЫсу е1 а1, Рйи8егз АгсЬ.

1991 41811-2):74-8; АЬгашосЬ)ап е~ а1. Ехр РЬузю1. 2010 ГеЬ;9512):265-73)? 2. В работе показано, что хроническое применение никотина пугем подкожных инъекций приводит к подавления активности а~ изоформы Ма,К-АТФазы, тогда как при пероральном применении вещества наблюдается снижение активности а~ изоформы, хотя суточные дозы никотина были сопоставимыми.

Чем обусловлена такие изоформ-специфические эффекты никотина? Не могут ли эффекты «перорального» никотина зависеть ог его метаболизма в печени„куда он попадает после всасывания в пищеварительном тракте? 3. Через 72 ч двигательной разгрузки в камбаловидной мышце крысы наблюдается снижение возбудимости мышечных волокон ~рис. 5.5), которое автор объясняет повышением проводимости мембраны или же частичной инактивацией натриевых каналов в результате развившейся деполяризации.

Нельзя ли объяснить снижение возбудимости просто уменьшением размеров мышечных волокон (увеличением их входного соцротнвления)? 4. Почему у крыс выносливость камбаловидной мышцы снижена после 24-ч двигательной разгрузки, но не изменена через 72 ч 1рис. 5.7)? 5. Инотропные эффекты кардиотонических стероидов автор объясняет нх влиянием на мьппечный электрогенез. Нельзя ли для объяснения полученных результатов привлечь данные литературы о запуске с участием Иа,К-АТФазы внутриклеточных сигнальных каскадов? Заключение.

Результаты диссертационной работы В.В.Кравцовой достоверны, сформулированные в ней научные положения и выводы полностью обоснованы. Диссертационная работа В.В,Кравцовой, является ценной научно- квалификационной работой, в которой на основании выполненных автором исследований разработаны принципиально новые теоретические положения о функциональной роли изоформ Ха,К-АТФазы, совокупность которых можно квалифицировать как важное научное достижение, заслуживающее пристальное внимание и уважение научной общественности.

Результаты работы характеризуется высокой научной новизной, они важны для развития биологических наук„фундаментальной и клинической медицины. Полученные экспериментальные данные могут служить теоретической основой для разработки новых подходов к медикаментозной и функциональной коррекции нарушений скелетных мышц при длительном снижении уровня их сократительной активности, а также представляют несомненныи интерес для преподавания физиологи~секи~ курсов, Счи~а~ нужным отметить, что сведения о роли Ха,К-АТФазы в функционировании нервно-мышечного синапса уже включены в программы читаемых мною учебных курсов для студентов биологического факультета (курс «Физиология висцеральных систем: современные проблемы») и факультета фундаментальной медицины ~курс «Нервная регуляция висцеральных функций») Московского государственного университета имени М.В,Ломоносова.

Таким образом, диссертация Кравцовой Виолетты Васильевны на тему «Функциональная гатерогенносп Ха,К-АТФазы в скелетной мышце», представленная на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.03.01-физиология, по содержанию, актуальности и научной новизне, объему экспериментального исследования, теоретическому и практическому значению полученных данных соответствует критериям п.9 "Положения о порядке присуждения ученых степеней", утвержденного постановлением Правительства РФ ог 24 сентября 2013 фо 842 предъявляемым к диссертациям на соискание ученой степени доктора биологических наук, а ее автор Кравцова Виолеты Васильевна заслуживает присвоения искомой степени доктора биологических наук по специальности 03.03.01- физиология.

Официальный оппонент: Профессор кафедры физиологии человека и животных биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московскйй государственный университет имейи М.В. Ломоносова», доктор биологическйх наук, доцент О,С.

Тарасова Адрес 119234, Москва, Ленинские горы, д. 1„ стр. 12, МГУ имени М.В. Ломоносова„биологический фшультет. Тел. +71495) 939-14-16 (раб.), +7~926)711-52-47 ~моб.), адрес электронной почты: оз1.шзи®рпа1!.согп Подпись руки профессора Тарасовой О.С, заверяю Декан биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, академик М.П,Кирпичников .