Отзыв официального оппонента 2 (Функциональная гетерогенность Na,K-АТФазы в скелетной мышце)

ОТЗЫВ официального оппонента на диссертационную работу Кравцовой Виолетты Васильевны «Функциональная гетерогенность Ма,К вЂ” АТФазы в скелетной мышце», представленной на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.03.01 — физиология Ыа,К вЂ” АТФаз а является классическим объектом нейро физиологи и, поскольку обеспечивает одну из основных функций клетки — поддержание градиентов основных клеточных и в неклеточных катионов.

Она осуществляет преобразование химической энергии АТФ в энергию неравновесного распределения ионов. В дальнейшем эта энергия преобразуется в энергию мембранного потенциала, которая, в свою очередь, используется для генерации и проведения электрических сигналов. К тому же Ха,К вЂ” АТФаза сама создает весьма заметный компонент потенциала за счет несимметричного переноса ионов. Иа'/К -АТФаза была открыта Йенсом Скоу в 1957 году. Он выделил этот фермент из периферических нервов с помощью уабаина — специфически связывающегося с АТФазой гликозида. В 1997 году за это открытие он был удостоен Нобелевской премии по химии. Неудивительно, что такой важный фермент является предметом интенсивных исследований. Как и в случае многих других белков простая однородная парадигма функции Ха'/К'-АТФазы устарела.

В настоящее время совершенно ясно разнообразие функций, изоформ и отдельных пулов Ма /К"-АТФазы. Хотя изоформы имеют высокую степень гомологии, они различаются по чувствительности к ионам натрия и калия, АТФ, гормонам и физиологическим стимулам, а также к специфическому ингибитору Ха,КАТФазы уабаину и другим сердечным гликозидам.

Было показано, что градиенты Ха~ и К+ в покое в основном поддерживает 1-изоформа, выполняющая основную насосную функцию; вклад 2-изоформы в поддержание ионных градиентов и мембранного потенциала покоя мышечных волокон невелик. Обнаружена существенная неоднородность распределения 1- и 2- изоформ Ха,К-АТФазы в плазматической мембране и таких мембранных компартментах, как Т-система и кавеолы. Важнейшим достижением последних лет стало выявление сигнальной функции Ха,КАТФазы, что расценивается в качестве нового принципа регуляции свойств клетки.

Именно анализ подобных тонких явлений и является на сегодняшний день предметом активного изучения. Именно этому, как следует из формулировки цели и задач, посвящена работа В.В.Кравцовой, актуальность которой, таким образом, несомненна. Диссертационная работа состоит из четырех больших блоков: локализация и функционирование 2-изоформы атфазы в концевой пластинке, хронические эффекты никотина в скелетной мышце изоформ-специфическое влияние двигательной разгрузки на атфазу, кардиотонические стероиды и сократительная функция.

Наличие нескольких частей исследования типично для диссертаций на соискание степени доктора наук, однако во многих случаях их обьединение под одной «обложкой» является искусственным. Рассматриваемая работа лишена подобного недостатка: все части действительно органично связаны единой целью исследования и представляют собой подходы к решению фундаментальной научной проблемы. Следует отметить и разнообразие методик, используемых автором для решения конкретных задач. В комплекс экспериментальных подходов входит Микроэлектродная регистрация, Механография, К онфокальная микроскопия, Количественная полимеразная цепная реакция, Вестерн-блот анализ, Пламенная фотометрия, Двигательная разгрузка, Локальная доставка никотина к мышце.

При решении каждой конкретной задачи автором получены результаты высокого качества и научной значимости. Это подтверждается и внушительным списком опубликованных работ, опубликованных в научных журналах, как российских, так и международных, имеющих высокий научный престиж и жесткую систему рецензирования. Таким образом, новизна и достоверность результатов сомнения не вызывают. В работе в частности установлен адаптационный характер функциональных изменений 2-изоформы Ма,К-АТФазы; эти изменения проявляются по-разному для постсинаптического и внесинаптического пулов 2-изоформы без нарушения ее локализации в сарколемме.

Наблюдаемые изменения сопровождаются дестабилизацией липид-упорядоченной фазы сарколеммы за счет частичной утраты мембранного холестерина, а также нарушениями распределения никотиновых холинорецепторов и структуры концевых пластинок. Также среди полученных автором результатов хочется отметить разработку гипотезы о существовании функционального молекулярного комплекса АТФазы с никотиновым холинорецептором. По мнению автора, результатом этого взаимодействия является локальная гиперполяризация мембраны концевой пластинки, вызываемая наномолярными концентрациями негидролизованного ацетилхоли на, которую можно рассматривать как физиологический механизм, препятствующий инактивации Ха каналов и поддерживающий гарантийный фактор нервно- мышечной передачи. Хотя эта гипотеза требует дальнейшей верификации, она дает перспективное направление дальнейших исследований.

Сама диссертационная работа построена по классической схеме, хорошо написана и иллюстрирована. Следует положительно оценить то, что помимо общего обзора литературы и общего обсуждения, каждая из больших глав имеет собственное введение и обсуждение. Такое построение заметно облегчает восприятие материала. Выводы работы корректно отображают суть работы.

При этом хочется отметить, что выводы не просто кратко повторяют результаты, а представляют собой их обобщение. Именно такого рода выводов стоит ожидать от диссертации на соискание степени доктора наук. У меня нет значительных замечаний по существу работы. И все же следует высказать ряд вопросов и замечаний. 1. При обсуждении вопроса взаимодействия АТФазы и никотиновых холинорецепторов как-то упущена возможность опосредования этой связи посредством ионов кальция, которые также проходят через канал холинорецептора.

Эги ионы могут оказывать локальное воздействие прежде чем будут хелатированы буфером. Каково мнение автора по поводу такой возможности. 2. Современная микроскопия (РКБТ) позволяет установить факт близкой локализации белков. Считает ли автор возможным использование этих подходов для выявления локализации АТФазы и холинорецепторов? 3.

Вопрос о функциональной значимости обнаруженных эффектов требует дополнительного пояснения. Обнаруженные эффекты достаточно тонкие. Их роль была бы понятна в центральных синапсах, где тонкий баланс возбуждения и торможения играет решающую роль. Но неочевидна их значимость в нервно-мышечном синапсе, обладающем высоким коэффициентом надежности. В целом, диссертация Кравцовой Виолетты Васильевны на тему «Функциональная гетерогенность Ма,К вЂ” АТФазы в скелетной мышце»,представленная на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.03.01 — физиология, по содержанию, актуальности и научной новизне, объему экспериментального исследования, теоретическому и практическому значению полученных данных соответствует критериям п.9 "Положения о порядке присуждения ученых степеней", утвержденного постановлением Правительства РФ от 24 сентября 2013 № 842„предъявляемым к диссертациям на соискание ученой степени доктора биологических наук, а ее автор, Кравцова Виолетта Васильевна, заслуживает присвоения искомой степени доктора биологических наук по специальности 03.03.01 — физиология.

Зам. директора ИЭФБ РАН член-корреспондент РАН д.б.н. Заведующий лабораторией биофизики сннаптических процессов Тихонов Денис Борисович 28 мая 2018 194223, Россия, г. Санкт-Петербург, проспект Тореза, д. 44,Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им.

И. М. Сеченова РАН, ввъиерЬЬ.гп, +7(812) 552-79-01, +7(812)-552-31-38, беп1зйИюпоч2002®уаЬоо.сопз "ттод1 иск рябы ~Ы'--: ~ удое"жасраем ф~~ ~~: ~'~~ ~ ~ ~ ) ан:~з ' ~'»- лоле~ 'е '~' Л""~"'"'™м~' ';„~'! Кфм~ф~~~' )аткм н,*1стк~уг.~ ~вывсирю~пюй 'Р",,:"~".4~~увФ ' ого.ьекеквюмк ив. и.м. сс'илмаре .