Автореферат (Циклический инжекционный анализ лекарственного растительного сырья с вскрытием проб в УЗ-поле), страница 2

Работа изложена на 112 страницах текста, содержит14 таблиц и 43 рисунка.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВовведениикраткообосновываетсяактуальностьразработкиаэрогидравлической схемы циклического инжекционного спектрофотометрическогоанализа ЛРС с извлечением аналитов в раствор в УЗ-поле. Формулируются цель изадачи исследования.Глава 1. Обзор литературыВ первой главе представлен обзор литературы, в котором последовательнорассматриваются возможные общие подходы к автоматизации фармацевтическогоанализа на принципах проточных методов. Сопоставляются их преимущества инедостатки.

Последовательно рассматриваются известные проточные методы,применимые при определении различных БАВ в ЛРС и ЛП. Обсуждаются проблемыавтоматизации стадии пробоподготовки в проточных методах. Акцентируетсявнимание на возможных способах детектирования аналитов, в том числе напреимуществах спектральных методах детектирования. Отмечается, что большинствоизвестных автоматизированных методик в условиях проточного анализапредполагают неравновесные условия образования аналитических форм.

В качествевозможной альтернативы неравновесным методам рассматриваются равновесные:проточно-порционный и циклический инжекционный анализ, в которыхобеспечивается смешение пробы и растворов реагентов в специальных смесительныхкамерах, что и обеспечивает возможность создания равновесных условий образованияаналитических форм. Представлены фармакологические и биологические свойствафлавоноидов, антрахинонов и аскорбиновой кислоты, а также методы ихопределения. В заключение этой главы обосновывается актуальность поискаметодических решений, которые позволили бы автоматизировать процесс извлеченияБАВ из проб ЛРС непосредственно в условиях ЦИА.Глава 2.

Аэрогидравлическая схема циклического инжекционного анализалекарственного растительного сырья с вскрытием проб в УЗ-поле, и ееобоснованиеДля создания условий полной автоматизации процесса извлечения аналитов изтвердофазных проб ЛРС для их последующего определения, в отличие от ранее6предложенных схем ЦИА, в разработанной схеме (рис. 1) предполагается коммутациянескольких кранов-переключателей и включение в качестве вспомогательныхустройствпробоподготовки(ВУП)специальныхкартриджейсполитетрафторэтиленовыми (ПТФЭ) фильтрами, которые помещены в УЗ-ванну срегулируемыми температурными режимами и коммутируются с каналами одного изкранов.

Число картриджей ограничено количеством каналов используемого крана. Вкартриджах производится экстракционное извлечение аналитов из ЛРС ипоследующее отделение экстракта от «отработанного» сырья. Второй кранпредназначен для автоматизации процесса образования аналитической формы вреакционной емкости (РЕ) при смешении в ней экстракта и растворов реагентовпотоком газовой фазы.Рис. 1. Принципиальная схема циклического инжекционного анализа лекарственногорастительного сырья с вскрытием проб в УЗ-поле: 1, 2, 3 – картриджи с ПТФЭ фильтрами; 4– УЗ-ванна; 5, 7 – многоходовые краны-переключатели; 6 – перестальтический реверсивныйнасос; 8 – реакционная емкость; 9 – проточная кювета, подключенная с помощьюоптоволоконных кабелей к источнику света и спектрометру.В картриджи воронкообразной формы (высота – 50 мм, внутренний диаметр – 5мм) помещены пористые ПТФЭ фильтры соответствующих размеров, изготовленныеиз порошка ПТФЭ (Фторопласт-4) двухстадийным спеканием с промежуточнымизготовлением ПТФЭ пластины и отборкой фракции частиц с размером 0,45 – 0,9 мм.Разработанная аэрогидравлическая схема обеспечивает возможность полнойавтоматизации процесса извлечения аналитов из твердофазных проб ЛРС и ихпоследовательное детектирование в равновесных условиях.Глава 3.

Методика экспериментальных исследованийВ данной главе описаны средства измерений, вспомогательные устройства иоборудование, реактивы и материалы, а также процедуры приготовления растворовнеобходимых реагентов.7Глава 4. Разработка методики циклического инжекционногоспектрофотометрического определения флавоноидов в лекарственномрастительном сырьеПервой иллюстрацией возможностей ЦИА в модифицированном под анализЛРС варианте явилась автоматизация методики определения флавоноидов вразличном ЛРС. На основе обзора известных решений проблемы определенияфлавоноидов в ЛРС и ЛП был сделан вывод, что для проточного определенияфлавоноидовврастительномсырьенаиболеепредпочтителенспектрофотометрический метод детектирования, обеспечивающий надежность ипростоту анализа.

Для определения флавоноидов была выбрана известнаяселективная реакция образования их комплексов с ионами алюминия (III). Выбраннаяреакция рекомендована для определения флавоноидов в ЛРС Государственнойфармакопеей XI издания. Однако эта реакция является кинетически замедленной.Общим решением для преодоления кинетических ограничений приобразовании аналитических форм является проведение фотометрических реакций всредах ПАВ за счет катализа подобных аналитических реакций.

Но возможностьреализации подобного решения для случая определения флавоноидов требовалаэкспериментальной проверки, так как ранее не была изучена.Влияние катионных, анионных и неионогенных ПАВ на скорость образованияаналитической формы рутина было исследовано на примерах цетилпиридинияхлорида (ЦПХ), додецилсульфата натрия и Triton X-100 соответственно, ипредставлено на рис. 2.Рис. 2. Влияние различных ПАВ наскорость образования комплексарутина с ионами алюминия (III): 1 –без ПАВ; 2 – Triton X-100; 3 –додецилсульфат натрия; 4 – ЦПХ(C(рутин) – 0,8 мМ, C(ПАВ) – 2,8мМ, С(Al (III)) – 40 мМ).Согласно полученным данным, при прочих равных условиях добавлениелюбого из ПАВ приводит к увеличению оптической плотности раствора.Максимальный эффект проявляется в присутствии ЦПХ (рис.

2, кривая 4). В этомслучае скорость протекания фотометрической реакции значительно возрастает. Длядостижения близкого к максимальному значению оптической плотности достаточно 5мин вместо 30 мин (без ПАВ). В данных условиях формируются комплексы,обусловленные взаимодействием молекул катионных ПАВ с молекуламифлавоноидов, которые в свою очередь образуют агрегативно устойчивые иинтенсивно окрашенные растворы аналитических форм с ионами алюминия (III).Кроме того, введение ЦПХ приводит к увеличению молярного коэффициентасветопоглощения. При этом молярный коэффициент светопоглощения комплексарутина с ионами алюминия (III) равен 1,9·104 л/моль·см (λ = 415 нм), а без введенияЦПХ – 1,6 ·104 л/моль·см соответственно.8Константы скоростей реакций комплексообразования рутина с ионамиалюминия (III) в присутствии и без ЦПХ были найдены путем построениякинетических зависимостей, которые составили соответственно (1,8 ± 0,1) ·104 и (8,8± 0,1)·103 мин-1.моль-2.л2.

Из полученных данных следует, что в присутствии ЦПХскорость спектрофотометрической реакции удваивается.Для достижения оптимальных условий протекания спектрофотометрическойреакции было изучено влияние концентрации ионов алюминия (III) и ЦПХ.Экспериментально были выбраны значения концентраций ионов алюминия (III) иЦПХ равные 1,7 и 0,1 мМ соответственно в качестве оптимальных (рис. 3 и 4).При оптимизации условий выполнения анализа по ЦИ-схеме было изученовлияние температуры на процесс образования аналитической формы рутина вдиапазоне от 20 оС до 50 оС. Было установлено, что повышение температурыпрактически не влияет на оптическую плотность растворов.Рис. 3.

Влияние концентрации ионовалюминия (III) на оптическую плотностьраствора аналитической формы рутина(C(рутин) – 50 µМ, C(ЦПХ) – 0,1 мМ).Рис. 4. Влияние концентрации ЦПХ наоптическуюплотностьрастворааналитической формы рутина (С(рутин) – 50µМ, С(Al (III)) – 1,7 мМ).Для различного сырья (травы зверобоя, цветков ромашки и календулы) былаизучена возможность извлечения флавоноидов в растворы различных ПАВ и этанола.Установлено, что оптимальные условия извлечения флавоноидов с точки зренияминимизации временных затрат и реактивов – нагревание 0,1 г пробы в УЗ-ванне (130Вт, 35 кГц) при 60 оС с 2 мл 70 % этилового спирта в течение 10 мин.

При найденныхусловиях наблюдается максимальная эффективность извлечения.В варианте методики, адаптированной к разработанной схеме ЦИА, в трисъемных картриджа (1, 2, 3) помещали по 0,1 г измельченной пробы (размер частицменьше 1 мм) (рис. 5). Далее все картриджи подключали к многоходовому крану (5) ипомещали в УЗ-ванну (4). После этого в каждый картридж последовательно подавалипо 2 мл 70 % этанола (кран 7, d) через краны (5 и 7) с помощью перистальтическогонасоса (6).

Затем в течение 10 мин производили УЗ воздействие при температуре 60оС на пробы в картриджах.На следующем этапе через краны (5, 7) с помощью реверсивного насоса (6) вРЕ (8, 9, 10) последовательно подавали по 100 мкл экстрактов, полученных вкартриджах (1, 2, 3), 300 мкл 1,7 мМ AlCl3 (5, f) и 300 мкл 0,1 мМ ЦПХ (7, e).Растворы в РЕ (8, 9, 10) перемешивали потоком воздуха (кран 5, d) в течение 10 с соскоростью 6 мл/мин и выдерживали 5 мин при температуре 25 оС.9Рис. 5.

Схема ЦИ-определения флавоноидов в ЛРС: 1, 2, 3 – картриджи с ПТФЭ фильтрами;4 – УЗ-ванна; 6 – перистальтический реверcивный насос; 5, 7 – многоходовые краныпереключатели; 8, 9, 10 – реакционные емкости; 11 – проточная кювета, подключенная спомощью оптоволоконных кабелей к источнику света и спектрометру.На следующем этапе растворы аналитических форм из РЕ (8, 9, 10) припереключении кранов-переключателей (5, 7) и реверса насоса (6) последовательноперекачивали в кювету (11) спектрофотометрического детектора, измерялиоптическую плотность растворов пробы (λ = 415 нм) в условиях остановленногопотока в течение 10 с и растворы сбрасывали.Затем коммуникации системы промывали 70 % раствором этанола (7, d) иизмеряли фоновый сигнал при заполнении кюветы смешанным раствором экстракта,70 % раствора этанола и 0,1 мМ ЦПХ (1:3:3).

Разность сигналов пробы и фонаиспользовалась для расчета содержания флавоноидов в ЛРС.В работе было изучено влияние на результаты определения флавоноидовнекоторых соединений, вступающих в реакции комплексообразования с ионамиалюминия (III), имеющих фенольные, карбоксильные и гидроксильные группы намодельных спиртовых растворах рутина. Было обнаружено мешающее влияниесахаров, в том числе глюкозы, при их 10-кратном избытке.Аналитические характеристики разработанной методики представлены в табл.1.