Автореферат (Роль надпочечников в регуляции метаболизма меди в печени)

На правах рукописиЗАТУЛОВСКАЯЮлия АлександровнаРОЛЬ НАДПОЧЕЧНИКОВ В РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА МЕДИ ВПЕЧЕНИ03.01.04 – биохимияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСАНКТ-ПЕТЕРБУРГ20142Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательномучреждении высшего образования “Санкт-Петербургский государственныйполитехнический университет” и Федеральном государственном бюджетномучреждении“Научно-исследовательскийинститутэкспериментальноймедицины” Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наукНаучный руководитель:доктор биологических наук, профессорПучкова Людмила ВалентиновнаОфициальные оппоненты: Шпаков Александр Олегович, доктор биологическихнаук, Федеральное государственное бюджетноеучреждениенаукиИнститутэволюционнойфизиологии и биохимии им.

И.М. СеченоваРоссийскойакадемиинаук,заведующийлабораторией молекулярной эндокринологии.Дубинина Елена Ефимовна, доктор медицинскихнаук, профессор, Федеральное государственноебюджетноеучреждение“Санкт-Петербургскийнаучно-исследовательскийпсихоневрологическийинститут им. В.М. Бехтерева Министерстваздравоохранения и социального развития РоссийскойФедерации”, главный научный сотрудник отделенияклинико-диагностических исследований.Ведущее научное учреждение: Федеральное государственное бюджетноеучреждение науки Институт цитологии Российской академии наук.Защита состоится 25 декабря 2014 г.

в 16.00 часов на заседанииДиссертационного совета Д 212.232.10 при Федеральном государственномбюджетном образовательном учреждении высшего профессиональногообразования “Санкт-Петербургский государственный университет” по адресу:199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 90.С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. А.М. ГорькогоФедерального государственного бюджетного образовательного учреждениявысшегопрофессиональногообразования“Санкт-Петербургскийгосударственный университет” (г.

Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9).Автореферат разослан«_____» ноября 2014 г.Ученый секретарь Диссертационного совета,доктор биологических наук, профессорЕ.Е. Ляксо3О Б Щ А Я ХА Р А К Т Е Р И С Т ИК А Р А Б О Т ЫАктуальность темы исследованияПо классификации элементов живого медь входит в группу микроэлементови является одновременно обязательным компонентом всех организмов итоксическим агентом. Незаменимость меди для млекопитающих обусловленатем, что она является каталитическим и структурным ко-фактором ферментов,контролирующих базовые метаболические процессы (Tapiero et al., 2003).Осуществление каталитических функций меди связано с изменением состоянияокисления Cu(I)↔Cu(II).

Активные центры купроэнзимов имеют высокоаффинные сайты связывания атомов меди с большим координационным числом.Они прочно удерживают медь в обоих состояниях окисления (Rubino and Franz,2012). Вне координационных сфер ионы меди индуцируют образованиесвободных радикалов кислорода, которые, действуя подобно ионизирующемуизлучению, вызывают окислительный стресс (Kozlowski et al., 2014). Извнеклеточной среды к местам формирования купроэнзимов медь безопаснодоставляется с помощью медь-транспортных белков. Они принадлежат кразличным семействам, относятся к интегральным мембранным илирастворимым белкам, расположены в плазматической мембране, цитозоле,митохондриях, аппарате Гольджи, лизосомах (Nevitt et al., 2012).

Медьтранспортные белки содержат разнообразные Cu(I)-связывающие мотивы: смаленьким и большим координационным числом, с высокой и низкойаффинностью, с различной комбинацией лигандов. Каждый из них удерживаетатом меди, но при локальном изменении окислительно-восстановительногопотенциала или рН среды, в присутствии другого транспортера меди в апо-формеили апо-купроэнзима атом меди может быть легко передан. Передача медипроисходит при прямом специфическом взаимодействии транспортеров внаправлении снижения энергии связывания. Медь, теряемая в результатеврожденных дефектов транспортеров или активных центров купроэнзимов,аккумулируется в клетках и провоцирует развитие онкологических инейродегенеративных заболеваний (Gaggelli et al., 2006).Биологическая роль меди не ограничивается участием в биокатализе.Внутриклеточные и внеклеточные локальные изменения концентрации медиконтролируют сигнальные пути (Mufti et al., 2007; Turski et al., 2012; Ioannoni etal.

2012; Bartuzi et al., 2013), модулируют работу рецепторов факторов роста, γаминомасляной кислоты, глутамата, -аминобутириловой кислоты испособствуют работе потенциал-управляемого Ca(II)-канала (Finney et al., 2007;Gaier et al., 2013). Таким образом, медь можно отнести к сигнальным молекулам.Выполнение этой функции требует двух условий: (1) существование медьрегулируемых сенсоров и (2) наличие пула меди, который аккумулирует и легкоосвобождает ее.

У млекопитающих к медь-регулируемым сенсорам относятсятранскрипционный фактор Sp1 (Liang et al., 2012) и семейство лизилоксидазоподобных белков (LOXL1-4), дисбаланс функции которых приводит к ускорениюроста опухолей (Nishioka et al., 2012). Контроль над локальными изменениямиконцентрациивнутриклеточноймедиобеспечиваетсистема4металлотионеин/глутатион/COMMD1, которая связывает медь и затемраспределяет ее между купроэнзимами, депонирует или способствует выведению(Vasak and Meloni, 2011; Fedoseienko et al., 2014). Изменение уровня содержаниямеди в циркуляции зависит от активности гена церулоплазмина (ЦП) в печени,контролирующего статус меди в крови и обеспечивающего медью клетки другихорганов. Периферические органы, нуждающиеся в меди, индуцируют ееосвобождение из печени в кровоток через транс-факторы, природа которыхостается не известной (Kim et al., 2010; Babich et al., 2013).

С другой стороны,показано, что медь в надпочечники поступает по механизму, сходному с таковымв печени (Hanson et al., 2001; Zatulovskiy et al., 2012), а адреналэктомиязадерживает экскрецию меди в желчь (Gregoriadis and Sourkes, 1970; Prohaska etal., 1988; Fields et al., 1991). Эти факты позволяют предположить, чтонадпочечники контролируют метаболизм меди в печени, однако сведения ометаболизме меди в самих надпочечниках отсутствуют. Изучение метаболизмамеди в них и влияния адреналэктомии на молекулярно-генетические механизмы,контролирующие баланс меди в печени, является вкладом в общее пониманиемеханизма,поддерживающегогомеодинамикумедиворганизмемлекопитающих.Цель работыЦелью настоящего исследования было изучение влияния надпочечников наметаболизм меди в печени, и особенностей метаболизма меди в печени инадпочечниках в течение постнатального развития.Задачи исследования1.

Оценить изменение показателей статуса меди в сыворотке крови крыс послепроведения адреналэктомии (АЭ).2. Сравнить метаболизм меди в печени контрольных и АЭ крыс: определитьконцентрацию и внутриклеточное распределение меди в гепатоцитах,оценить активность генов медьтранспортных белков и купроэнзимов науровне транскрипции, трансляции и ферментативной активности.3. Изучить особенности эмбрионального типа метаболизма меди и егопереключения на взрослый тип в печени крыс.4. Охарактеризовать метаболизм меди в надпочечниках крыс на разных срокахонтогенетического развития.Научная новизнаОхарактеризован метаболизм меди в организме АЭ крыс.

Показано, что АЭне вызывает изменения уровня экспрессии генов, ассоциированных с обменоммеди, но приводит к повышению показателей статуса меди в сыворотке крыс,накоплению меди в печени, а также перераспределению меди между клеточнымикомпартментами гепатоцитов (список генов, взятых в рассмотрение, и краткоеописание их функций помещены в конце автореферата). Продемонстрированонарушение металлирования СОД1 и увеличение нагрузкимедьюметаллотионеина (МТ), выполняющего функцию клеточного депо меди. АЭприводит к изменению митохондриального протеома. Показана неоднородностьпопуляции митохондрий в клетке. Выделена и очищена фракция митохондрий,седиментирующая с ядерной фракцией. В результате АЭ в данной фракции5митохондрий происходит снижение отношения мтДНК/субъединица 4 цитохромс-оксидазы (COX4).В работе показано, что накопление меди в гепатоцитах крыс в периодэмбрионального типа метаболизма меди начинается в ядрах, однако после 5-годня жизни основная часть меди переносится в митохондриальную фракцию.Метаболизм меди в печени новорожденных крыс, по сравнению с взрослымиживотными, характеризуется низкой активностью генов Ctr1, Cp, Ccs,отсутствием экспрессии гена Atp7b, ген Mt1a экспрессируется активно.В надпочечниках концентрация меди сразу после рождения начинаетснижаться, и уже к 5-му дню жизни содержание меди достигает значения,характерного для взрослых животных.

Экспрессия генов медьтранспортныхбелков и купроэнзимов соответствует таковой для клеток негепатоцитарныхрядов: и у новорожденных, и у взрослых крыс активен только ген Atp7a, но неAtp7b, активна экспрессия гена Ctr1, ген Cp экспрессируется, но продуцируетсялишь мРНК, кодирующая сплайс-изоформу ЦП (ЦП, заякоренный в мембранучерез гликозилфосфатидилинозитоловый якорь (ГФИ-ЦП)).Теоретическая и практическая значимость работыВ работе впервые показано, что 1) у млекопитающих надпочечникиосуществляют надорганную регуляцию гомеодинамики меди, и 2) как уноворожденных, так и у взрослых млекопитающих метаболизм меди внадпочечниках отличается от метаболизма меди в печени и сходен с таковым вклетках негепатоцитарных рядов.