Автореферат (Роль надпочечников в регуляции метаболизма меди в печени), страница 2

Изучение механизмов, лежащих в основе этихпроцессов, представляется важной фундаментальной задачей. Даженезначительное нарушение в экспрессии генов медь-связывающих белковприводит к развитию тяжелых заболеваний (опухолевый рост, нейродегенерация,диабет, остеопороз и др.). Знания о метаболизме меди в отдельных органах и егоспецифическом изменении в течение онтогенеза являются важными дляустановления этапов, нарушения в которых могут приводить к развитиюпатологических процессов.

Кроме того, полученные данные в дальнейшем могутспособствовать выяснению причин повышения концентрации меди в печени иповышения уровня ЦП в крови при некоторых патологических состояниях,например, при росте опухолей.Методология и методы исследованияИсследование выполнено на лабораторных грызунах с применениемсовременных методов биохимии и молекулярной биологии: ОТ-ПЦР, ПЦР,электрофорез в ПААГ и агарозном геле, иммуноэлектрофорез, 2D-электрофорез,иммуноблотинг, определение активности ферментов спектрофотометрически и вгеле,хроматография,иммунопреципитация,дифференциальноецентрифугирование, равновесное ультрацентрифугирование, определениеконцентрации общего белка и РНК, атомно-абсорбционная спектрометрия.Использованы методы статистического компьютерного анализа.Положения, выносимые на защиту1. Надпочечники влияют на метаболизм меди в печени.

У АЭ крыс происходитповышение содержания ЦП и уровня его (ферр)оксидазной активности всыворотке крови. В гепатоцитах увеличивается общая концентрация меди.6Медь аккумулируется в цитозоле в составе МТ и низкомолекулярногокомплекса, ее содержание в митохондриях снижается, нарушаетсяметаллирование цитозольных и секреторных купроэнзимов, изменяетсяпротеом митохондрий.2. В период эмбрионального типа метаболизма меди (ЭТММ) медь,аккумулированная в печени, перераспределяется между ядром имитохондриями.

Перераспределение меди между органеллами несопровождается изменением профиля или уровня активности генов,участвующих в обмене меди. У новорожденных металлирование СОД1осуществляется без участия CCS. Переключение на взрослый типметаболизма меди (ВТММ) сопровождается изменением профиля и уровняактивности генов метаболизма меди: репрессируется ген Аtp7a иактивируется ген Аtp7b, активность генов Cp, Ctr1 и Ccs повышается,активность гена Мt1а понижается.3. В процессе постнатального онтогенеза профиль и активность геновметаболизма меди в надпочечниках не претерпевает значительныхперестроек.

Метаболизм меди в них сходен с таковым в клеткахнегепатоцитарных рядов.Апробация результатов исследованияРезультаты исследования были доложены на российских и международныхконференциях: 15-ая Пущинская международная школа-конференция молодыхученых “Биология – наука 21 века” (Пущино, 2011), 11th International Symposiumof Metal Ions in Biology and Medicine (Кембридж, Великобритания, 2011), 16-аяПущинская международная школа-конференция молодых ученых “Биология –наука 21 века” (Пущино, 2012), 8th International Copper Meeting “Copper inBiology” (Альгеро, Италия, 2012), International Workshop on Human Disorders ofCopper Metabolism: Recent Advances and Main Challenges (Балтимор, США, 2013),Молодежная научная конференция в рамках Политехнического молодежногофестиваля науки (Санкт-Петербург, 2013), 38th FEBS Congress 2013 “Mechanismsin Biology” (Санкт-Петербург, 2013), 42-ая Теоретическая и практическаяконференция с международным участием “Неделя науки в СПбГПУ” (СанктПетербург, 2013), The FEBS EMBO 2014 Conference (Париж, Франция, 2014), 4ый Съезд физиологов СНГ “Физиология и здоровье человека” (Сочи – Дагомыс,2014).ПубликацииПо материалам диссертации опубликовано 13 работ (2 статьи и 11 тезисовдокладов).Структура диссертацииРукопись содержит главы “Введение”, “Обзор литературы”, “Материалы иметоды”, “Результаты и обсуждение|”, “Заключение”, “Выводы” и “Списоклитературы”.

Диссертация изложена на 145 страницах, включая библиографию.Список литературы содержит 236 источников, из которых 12 на русском языке и224 на английском. Результаты представлены в 9 таблицах и иллюстрированы 53рисунками.7О С Н ОВ Н ОЕ С О ДЕ Р ЖА НИ Е РА Б О Т ЫМатериалы и методыРабота выполнена на крысах линии Вистар, а также их потомстве, полученном в виварииНИИ Экспериментальной медицины. Первым днем беременности считали день обнаружениясперматозоидов в вагинальных мазках.Животных подвергали двусторонней АЭ под легким эфирным наркозом.

После операцииАЭ крысы получали без ограничения раствор, содержащий 1% глюкозы, 1% NaCl и 0.5% KCl.Контрольная группа состояла из ложно-оперированных (ЛО) крыс. Забор крови и органовпроводили на 10-ый день после операции. С лабораторными животными обращались всоответствии с “Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых дляэкспериментов или в иных научных целях” (ETS №123 от 18.03.1986, Страсбург, Франция), атакже Поправкой к этой конвенции (ETS №170 от 02.12.2005). Исследования были одобреныЭтическим комитетом НИИ Экспериментальной медицины (протокол № 2/13 от 27.06.2013).В исследовании использованы антитела к следующим белкам, ассоциированным сметаболизмом меди: к церулоплазмину (ЦП) крысы, металлотионеину (МТ), COMMD1,супероксиддисмутазе 1 (СОД1) и субъединице 4 цитохром-с-оксидазы (COX4).

Выделениетотальной РНК проводили с помощью реактива “TRIzol” в соответствии с инструкциейпроизводителя. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически. Качествоиспользуемого препарата РНК проверяли методом электрофореза в агарозном геле и оботсутствии деградации РНК судили по соотношению 18S и 28S рРНК. Гель-электрофорезПЦР-продуктов проводили в агарозном геле. Гели окрашивали этидий бромидом. Обратнуютранскрипцию, сопряженную с ПЦР, проводили со специфическими праймерами (Ilyechovaet al., 2014; Клотченко и др., 2008).

Для полуколичественной характеристики экспрессии геновиспользовали соотношение между квазистационарным уровнем мРНК исследуемого гена имРНК β-актина. Выделение субклеточных фракций из гомогената ткани проводили методомдифференциального центрифугирования (Васин и др., 2005). Очистку полученных фракцийпроводили методом ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте плотности сахарозы(Zatulovskiy et al., 2012). Содержание мтДНК определяли методом ПЦР анализа соспецифическими праймерами в лизатах препаратов митохондрий. Гель-фильтрациюпроводили на колонке с Сефадексом G75 (Ilyechova et al., 2014). Электрофорез белковпроводили в ПААГ в неденатурирующих условиях, или в присутствии 0.1% додецилсульфатанатрия (ДСН) по методу Laemmli (1970).

Белки из геля переносили на нитроцеллюлознуюмембрану (НЦМ). Иммунные комплексы выявляли после гибридизации со вторымиантителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, с помощью метода усиленнойхемилюминесценции. При проведении денситометрического анализа белков для нормализациииспользовали зону, соответствующую примерно 50 кДа, из окрашенной Понсо S НЦМ(Aldridge et al., 2008). Концентрацию ЦП определяли с помощью ракетного количественногоиммуноэлектрофореза (Platonova et al., 2007). Оксидазную, ферроксидазную исупероксиддисмутазную активности определяли окрашиванием геля на соответствующиеферменты, используя специфические абиогенные субстраты: орто-дианизидин, система сольМора/ферроцин и нитротетразолий синий, соответственно (Ilyechova et al., 2014).

2Dэлектрофорез проводили в соответствии с протоколом, разработанным Нарыжным С.Н.(Naryzhny and Lee, 2003). Концентрацию металлов измеряли методом атомно-абсорбционнойспектрометрии (ААС) с электротермической атомизацией и зеемановской коррекциейнеселективного поглощения, либо методом пламенной фотометрии. Концентрацию общегобелка в пробах определяли по методу Bradford (1976). Для проведения поиска цис-элементов впромоторных областях генов использовали открытую он-лайн базу данных Ensembl(http://www.ensembl.org/index.html) и он-лайн сервис “RSA-tool” (http://rsat.ulb.ac.be/dnapattern_form.cgi).

Статистическую обработку результатов проводили с применениемдвустороннего критерия Стьюдента, а также дисперсионного анализа. Изменения принималистатистически значимыми при уровне значимости p < 0.05.8Результаты и обсуждение1. Влияние АЭ на метаболизм меди у крысВлияние АЭ на параметры метаболизма меди изучали на молодыхполовозрелых крысах. Эффективность АЭ контролировали по снижениюреабсорбции натрия.1.1. Изменения статуса меди в сыворотке крови крыс после АЭВ сыворотках крови животных были определены показатели статуса меди:концентрация общей меди, содержание белка ЦП и его ферментативнаяактивность и концентрация полипептидов МТ. Показано, что АЭ приводит кповышению концентрации меди в сыворотке крови (рисунок 1 А).

В результатеАЭ повышается содержание иммунореактивных полипептидов ЦП (рисунок 1 Б)и его обеих энзиматических активностей (рисунок 1 Г-Е).А – концентрация меди (n = 5). Б – ракетный иммуноэлектрофорез, гель окрашен ортодианизидином. Стандарт – препарат ЦП крысы в количестве 0.56, 0.28, 0.14 мкг/мкл. В –содержание полипептидов МТ по данным иммуноблотинга.

Г – оксидазная активность в ПААГ(n = 5), гель окрашен орто-дианизидином. Д – кинетика окисления орто-дианизидина. Черныелинии – ЛО, серые линии – АЭ. Е – ферроксидазная активность в ПААГ (n = 3), гель окрашенферроцином. * p < 0.05; ** p < 0.01Рисунок 1 – Изменения статуса меди в сыворотке крови крыс после АЭПропорциональное и согласованное повышение концентрации меди, уровняоксидазной и ферроксидазной активностей ЦП свидетельствует о том, чтобольшая часть ЦП в сыворотке крови находится в форме холо-фермента. Анализобразцов сыворотки крови методом иммуноблотинга обнаружил в них9присутствие полипептидов МТ и показал, что у АЭ крыс содержаниеполипептидов МТ выше (рисунок 1 В).1.2.