Автореферат (Роль надпочечников в регуляции метаболизма меди в печени), страница 4

По оси абсцисс: дни жизни до рождения (-4; -1) и послерождения (1-15). Б – концентрация меди в субклеточных фракциях гепатоцитов крыс. Данныеполучены совместно с Платоновой Н.А. и Самсоновым С.А. По оси абсцисс: дни жизни послерождения. ЭПР – эндоплазматический ретикулум, АГ – аппарат Гольджи.Рисунок 8 – Изменение содержания меди в печени (n = 3) и субклеточныхфракциях гепатоцитов крыс в период раннего онтогенетического развития (n = 5)Прогрессивное накопление меди в печени начинается в эмбриональном периодеи продолжается до 12-го дня постнатального развития включительно, после чегоконцентрация меди резко снижается до уровня, характерного для взрослых15животных. Полученные результаты согласуются с существующей концепциейЭТММ и ВТММ в печени крыс (Hurley et al., 1980). Определение концентрациимеди во внутриклеточных фракциях гепатоцитов, полученных методомдифференциального центрифугирования, показало, что в течение первых днейжизни медь аккумулируется в ядрах, но после 5-го дня происходит снижениеконцентрации меди в ядерной фракции.

В то же время, содержание меди вмитохондриях увеличивается, достигая максимального значения к концу периодаЭТММ (рисунок 8 Б). Полученные данные позволяют рассматриватьмитохондрии как органеллы, депонирующие медь в течение ЭТММ.В отличие от печени, снижение содержания меди в надпочечникахначинается сразу после рождения (рисунок 9 А).Рисунок 9 – Изменение концентрации меди в надпочечниках (А) и их массы (Б) укрыс в период раннего онтогенетического развития (n = 3)К 5-му дню жизни происходит снижение концентрации меди на ~40%, послечего она приближается к уровню, характерному для взрослых животных.Сравнение скорости роста надпочечников (рисунок 9 Б) и содержания в них медипозволяет предположить, что снижение концентрации меди может бытьследствием увеличения массы самих надпочечников, в то время как абсолютноеколичество меди в них остается неизменным.2.2.

Статус меди в сыворотке крови крыс в период раннего постнатальногоразвитияКак видно из представленных данных (рисунок 10 А), концентрации ЦП имеди, характерные для ВТММ, достигаются только к 40-му дню жизни. Втечение раннего постнатального периода уровни оксидазной и ферроксидазнойактивностей соответствовали концентрации меди и содержанию полипептидовЦП. Это позволяет считать, что основная часть сывороточного ЦП представленахоло-ЦП.

Из образцов сыворотки крови 6-дневных и взрослых крысиммунопреципитировалиЦПивиммунопреципитатахопределяликонцентрацию меди. Результаты показали, что основная часть сывороточноймеди ассоциирована с ЦП, как в период ЭТТМ, так и у взрослых крыс (рисунок10 Б). В то же время, как видно на рисунке 10 А, содержание меди в ЦПноворожденных крыс почти в 2 раза выше, чем у взрослых.16А – содержание меди (по данным ААС) и ЦП (по данным иммуноэлектрофореза) в сывороткекрови крыс в раннем постнатальном онтогенезе (n = 3). Б – содержание меди в сывороткекрови и иммунопреципитированной фракции ЦП (n = 3).

В – содержание полипептидов МТ (n= 4). Г – концентрация металлов во фракциях МТ (n = 2). По оси ординат отложен процент отобщей концентрации металла в сыворотке крови. * p < 0.05Рисунок 10 – Характеристика метаболизма меди в сыворотке крови крыс наранних сроках постнатального развитияПовышенное содержание атомов меди в молекуле ЦП новорожденных ранеебыло описано у человека и лошади (Okumura et al., 1998; Жигулева и др., 1999). Всыворотке крови крыс как в период ЭТММ, так и в период ВТММ присутствуетМТ (рисунок 10 В). У новорожденных с ним связано около 1% меди и 8% цинка,а у взрослых соответственно 0.5% и 2% (рисунок 10 Г).2.3.

Изменение профиля экспрессии генов, ассоциированных с метаболизмоммеди, в течение онтогенезаБылисформированытригруппыкрыс:3-дневныекрысы,характеризующиеся ранним постнатальным периодом ЭТММ (медьнакапливается в ядрах), 12-дневные крысы, поздний срок ЭТММ (медьаккумулируется в митохондриях), и 60-дневные крысы, в печени которыхметаболизм меди соответствует взрослому типу. Между данными для 3- и 12дневных животных значительной разницы выявлено не было, поэтому здесьпредставлены только данные, полученные на 3- и 60-дневных крысах.

Уживотных была измерена относительная концентрация зрелых транскриптовгенов, список которых приведен в разделе 1.5. Полученные данные представленына рисунке 11. Они показывают, что в течение онтогенеза в печени крыспроисходит увеличение экспрессии гена Cp (рисунок 11 А). Из двух генов,17кодирующих медь-транспортные АТФазы, у новорожденных крыс активноэкспрессируется Atp7a. После переключения на ВТТМ экспрессия гена Atp7aподавляется, в то же время экспрессия гена Atp7b возрастает.* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.005Рисунок 11 – Экспрессия генов, ассоциированных с метаболизмом меди, впечени (А) и надпочечниках (Б) крыс на разных этапах онтогенеза (n = 3)Экспрессия гена Ctr1 почти в 5 раз ниже, чем активность гена Ctr2.Количество мРНК, кодирующей белок CTR1, у взрослых крыс почти в 10 разбольше, чем у новорожденных крыс.

Соответствия между экспрессией геновSod1 и Ccs в печени 3-дневных крыс обнаружено не было: при активнойэкспрессии гена Sod1, относительное содержание CCS-мРНК остается оченьнизким. У взрослых крыс содержание СОД1-мРНК приблизительно на 30% выше(р < 0.05), чем у 3-дневных. В то время как экспрессия гена Ccs возрастает почтив 10 раз.

В течение ЭТММ экспрессия гена Mt1a сохраняется на довольно18высоком уровне, но после переключения на ВТТМ происходит двукратноеснижение активности данного гена. Экспрессия гена Commd1 в течениеонтогенетического развития не изменяется. Содержание COX4i1-мРНКувеличивается при смене типа метаболизма меди. Как и ожидалось, в печеникрыс не происходило экспрессии гена Pam.В клетках надпочечников крыс в течение развития не обнаруживаютсямРНК секреторного ЦП и ATP7B (рисунок 11 Б). В то же время, мРНК изоформыГФИ-ЦП и ATP7A присутствуют от рождения и у взрослых крыс их содержаниеувеличивается.

В надпочечниках активность гена Ctr1 выше у новорожденныхкрыс, она начинает снижаться перед сменой типа метаболизма меди. Ген Ctr2экспрессируется на постоянном уровне и этот уровень примерно в 2 раза ниже,чем активность гена Ctr1. Гены Sod1 и Ccs экспрессируются на близком уровне иих активность не меняется в течение онтогенеза. У взрослых ген Mt1a активнее,чем у новорожденных. Количество мРНК, кодирующей белок COMMD1,снижается у взрослых. Активность гена Cox4i1 не меняется с возрастом. Вотличие от печени, в надпочечниках наблюдалась активная экспрессия гена Pam,которая уменьшается у взрослых крыс.2.4.

Содержание белков, участвующих в метаболизме меди, в печени инадпочечниках крыс в течение раннего онтогенезаСодержание полипептидов белков, ассоциированных с метаболизмом меди,оценивали по результатам иммуноблотинга. При помощи специфических антителмитохондриальный белок COX4, а также цитозольные белки МТ, COMMD1 иСОД1 были выявлены в соответствующих субклеточных фракциях (рисунок 12).Относительная концентрация полипептидов МТ и COMMD1 внадпочечниках выше у взрослых крыс. В печени уровни концентрации МТ иCOMMD1 не изменяются при переключении типа метаболизма меди, хотясодержание МТ-мРНК у взрослых животных снижается почти в 2 раза посравнению с новорожденными крысами.

Стоит отметить, что рассогласованиемежду транскриптомом и протеомом характерно для многофункциональныхбелков, имеющих сложную систему регуляции экспрессии на уровнетранскрипции и/или трансляции. Оба белка МТ и COMMD1 являютсямногофункциональными (de Bie et al., 2005; Vasak and Meloni, 2011). Содержаниебелков COX4 и СОД1 не изменяется в надпочечниках крыс, в то время как впечени смена типов метаболизма меди сопровождается увеличениемконцентрации полипептидов этих белков.В цитозоле печени и надпочечников оценили также уровеньферментативной активности СОД1 (рисунок 13).19А – иммуноблотинг фракций цитозоля и митохондрий с антителами к МТ, COMMD1, COX4 иСОД1. Б и В – денситометрический анализ данных иммуноблотинга.

* p < 0.05Рисунок 12 – Содержание белков, связанных с метаболизмом меди внадпочечниках и печени крыс в течение онтогенеза (n = 3)А – ПААГ, окрашивание нитротетразолием синим. Б – денситометрический анализпредставленных гелей (А). * p < 0.05Рисунок 13 – Ферментативная активность СОД1 в печени и надпочечникахноворожденных и взрослых крыс (n = 3)Выше отмечено, что мРНК, кодирующая белок CCS, обнаруживается впечени новорожденных крыс в следовых количествах (рисунок 11 А). Возможно,в течение ЭТТМ металлирование апо-СОД1 осуществляется при помощи иногомеханизма, не зависящего от CCS, и доставку меди к СОД1 осуществляетглутатион, получивший медь от белка МТ (Carroll et al., 2004).ЗАКЛЮЧЕНИЕВ работе впервые продемонстрировано существование механизма,контролирующего круговорот меди на межорганном уровне.

Показано, что АЭ20приводит к повышению концентрации меди в печени, корковом слое почек игипоталамусе. В печени АЭ вызывает повышение содержание меди в цитозоле.Здесь концентрация меди в СОД1 снижается, но активность гена и содержаниеиммунореактивных полипептидов СОД1 не меняется. В цитозоле медь связана сМТ и входит в комплекс низкомолекулярных лигандов меди. Этот комплекспроявляетСОД-активностьвсистеме(нитротетразолийсиний/ТЕМЕД/рибофлавин).

Удельное содержание меди в митохондрияхснижается, по-видимому, за счет меди, не входящей в состав ЦО. Характеристикапротеома, проведенная в митохондриальной фракции гепатоцитов методомдвумерного электрофореза, показала, что АЭ вызывает изменение составапротеома.

Для идентификации обнаруженных изменений требуются дальнейшиеисследования. Профиль и уровень экспрессии генов, связанных с метаболизмоммеди, не изменяются в печени АЭ крыс, а сдвиги в распределении не являютсярезультатом дефицита гормонов надпочечников.Для изучения механизма, лежащего в основе влияния надпочечников нагомеодинамику меди в печени, необходимо понимать особенности метаболизмамеди в самих надпочечниках.

В литературе данные о метаболизме меди внадпочечниках отсутствуют. В работе проведена сравнительная характеристикаметаболизма меди в печени и надпочечниках крыс при ЭТММ и ВТММ.Накопление меди в гепатоцитах в раннем постнатальном онтогенезе начинается вядре, но после 5-го дня жизни медь аккумулируется в митохондриях, гдепродолжает накапливаться до 13-го дня жизни, когда происходит резкое падениеконцентрации меди в печени. В гепатоцитах новорожденных крыс, по сравнениюс взрослыми, специфически изменена активность генов, контролирующихпоступление меди в цитозоль, и генов, участвующих в металлировании ЦП иСОД1, основных купроэнзимов крови и цитозоля, соответственно.

Так,активность гена Ctr1, белковый продукт которого импортирует медь черезплазматическую мембрану в цитозоль, репрессирована. Напротив, ген Ctr2,белковый продукт которого переносит медь из лизосомального пространства вцитозоль, активен. Это однозначно указывает на то, что у новорожденных медьпоступает в гепатоциты эндоцитозом. В раннем постнатальном периоде из двухмедь-транспортных АТФ-аз экспрессируется в основном ген Atp7a, активностьгена Atp7b подавлена. Обе АТФ-азы переносят медь в цистернальноепространство аппарата Гольджи, где металлируются внеклеточные купроэнзимы.Специфическим донором меди для ЦП является ATP7B. В отсутствии егоактивности, и активность гена ЦП также снижена. Наконец, активность СОД1,главного клеточного купроэнзима, у новорожденных лишь на 30% ниже, чем увзрослых.