Автореферат (Регуляция активности протонных насосов растительной клетки в ходе роста растяжением), страница 4

Такойспособ регуляции уникален для АТФаз Р-типа (Duby, Boutry, 2007). Количествоэндогенного 14-3-3 белка, связанного с Н+-АТФазой, было пропорциональноуровню фосфорилирования (Kinoshita, Shimazaki, 2001). Фосфорилирование идефосфорилирование осуществляется двумя ферментами: киназой (CIPK) ифосфатазой (PP2C).14-3-3 белки кодируются семейством генов. Показано, что только малая группабелков, относящаяся к семейству non-epsilon, обладает способностью специфичносвязываться с Н+-АТФазой плазмалеммы. Анализ экспрессии генов, входящих всостав этой группы, выявил разнонаправленность изменения экспрессии. Тем неменее, большинство генов характеризовалось снижением уровня накоплениятранскриптов, что, однако, сопровождалось накоплением мембранно-связанных14-3-3 белков (данные приведены в тексте диссертации).

В тоже время экспрессиягенов, кодирующих киназу и фосфатазу, регулирующих динамическое состояниеН+-АТФазы, была максимальной на 2 неделю развития суспензионной культуры(данные приведены в тексте диссертации).Полученные данные указывают на многоуровневость пост-трансляционнойрегуляции. В этом процессе могут участвовать 14-3-3 белки, а также ферменты,модулирующие уровень фосфорилирования Н+-АТФазы плазмалеммы.Изменение экспрессии генов, кодирующих Н+-АТФазу тонопласта, в процессе ростаклеток суспензионной культуры табака VBI-0.С использованием проростков арабидопсиса было показано усилениеэкспрессии абсолютного большинства генов, кодирующих субъединицы этогофермента.

Эта же тенденция была показана и для клеток суспензионной культурытабака VBI-0.15Относительный уровень экспрессии генов1 нед 2 нед 3 недE Суб. 1нед37 кДаB Суб.56 кДа2нед3нед32.521.510.50**E Суб.32.521.510.50*11 Нед.нед22 Нед.нед3 Нед.недB Суб.Рис. 9. Интенсивность экспрессии генов, кодирующих субъединиц Н+-АТФазы тонопласты иблот-анализ количества субъединиц Н+-АТФазы, ассоциированных с тонопластом, в ходеразвития клеток суспензионной культуры клеток табака VBI-0.Наибольшее накопление продуктов транскрипции было свойственно длясубъединиц В, E, F и G1, входящих V1 домен, а также для субъединиц a2 и d V0комплекса.

Однако, как и в случае Н+-АТФазы плазмалеммы, амплитуда этих16изменений была малой по величине, но достаточной для увеличения содержанияфермента в составе очищенной везикулярной фракции тонопласта (Рис. 9).Увеличение экспрессии и накопление субъединиц фермента приводит кактивации его гидролитической активности, что продемонстрировано на Рис. 10.мкМоль Фн/мгбелка час121086420Рис. 10. Изменение гидролитическойактивности Н+-АТФазы очищеннойфракции тонопласта, полученной изклеток суспензионной культуры табакаVBI-0 разного возраста. Баф бафиломицин, 0,25 мкМ.рН 7,2 ДМСОрН 7,2 баф11 недweekнед 2weeks22неднед 3weeks33неднедТаким образом, протонная вакуолярная АТФаза, также как и Н+-АТФазаплазмалеммы, усиливает свою активность на этапе интенсивного ростарастяжением. И это усиление опосредовано накоплением транскриптов, а,следовательно, возможностью регуляции на транскрипционном уровне.Изменение экспрессии генов, кодирующих Н+-ПФазу тонопласта, в процессероста клеток суспензионной культуры табака VBI-0.Относительный уровеньэкспрессии геновАнализ экспрессии генов, кодирующих Н+-ПФазу тонопласта, в клеткахсуспензионной культуры табака VBI-0 показал, что 3 из 4 проанализированныхгенов отличаются снижением уровня накопления транскриптов.

Это снижениеполностью согласуется с данными об уменьшении числа ферментов в составетонопласта (Рис. 11), а также со снижением гидролитической активности фермента.21**222111** **00TVP 5мкмоль Фн/мкбелка/час*00TVP 92нед3нед21.540120072 кДа11неднед.22неднед.33неднед.11Нед.нед22Нед.нед33Нед.недTVP 31TVP 171 нед60** **0.5нед11 Нед.22 Нед.нед33 Нед.нед0PPIН+-ПФазаРис.

11. Изменение относительного уровня экспрессии генов, кодирующих Н+-ПФазытонопласта, гидролитической активности фермента и блот-анализ количества Н+-ПФазы,входящей в составе тонопласта, в ходе развития клеток суспензионной культуры клетоктабака VBI-0.17ЗАКЛЮЧЕНИЕСуммируя полученные данные, следует отметить, что в ходе реализации ростарастяжением происходит сложный процесс перераспределения значимостипротонных насосов растительной клетки. На первичном этапе роста лидирующееположение занимает Н+-ПФаза, роль которой заключается не только вподдержании рН цитоплазмы и генерации мембранного потенциала на тонопласте,но и, возможно, в регуляции уровня макроэргических соединений в ходеглюконеогенеза, а также изменении интенсивности везикулярной секреции.Регуляция работы фермента возможна на транскрипционном уровне, о чемсвидетельствуют последовательное уменьшение накопления транскриптов исоответствующее снижение представленности его белка в составе тонопласта, атакже коррелирующее понижение суммарной гидролитической работы фермента.Снижение роли Н+-ПФазы приводит или является следствием постепенногоувеличения роли АТФаз, локализованных как на плазмалемме, так и на тонопласте.Оба фермента отличались накоплением транскриптов на 2 неделю развития уклеток табака и на 6 день развития этиолированного проростка арабидопсиса, т.е.на этапе интенсивного роста растяжением.

Завершение ростовых процессовсогласуется с общим снижением активности всех анализируемых протонтранспортирующих ферментов. Однако для АТФаз этот декремент был менеезначительным, чем для пирофосфатазы, что может объясняться сохранением дляэтих ферментов так называемых функций «домашнего хозяйства», например,поддержания уровня рН и интенсивности транспортных процессов наплазмалемме и тонопласте. Динамика активности изучаемых протонных помппредставлена на Рис. 12.Начало ростаИнтенсивный ростЗавершение ростаРис. 12.

Модель изменения активности протон-транспортирующих ферментов растительнойклетки в ходе роста растяжением. Синим отмечена Н+-АТФаза плазмалеммы, зеленым – Н+АТФаза тонопласта и серым – Н+-пирофосфатаза тонопласта.Таким образом, впервые показана возможность перераспределения значимостипротонных насосов плазмалеммы и тонопласта в процессе реализацииосновополагающего физиологического процесса – роста растяжением. Доказанарегуляция работы Н+-помп на транскрипционном, и выявлена динамика рядарегуляторных механизмов на пост-трансляционном уровнях.18ВЫВОДЫ1.

Показано, что усиление экспрессии ряда генов семейств АНА и PMA,сопровождается увеличением количества белка Н+-АТФазы в составеплазмалеммы и соответствует интенсивному росту растяжением клетокгипокотилей проростков арабидопсиса и суспензионной культуры VBI-0;2. Этап интенсивного роста растяжением клеток суспензионной культурытабака VBI-0 сопровождается максимальным увеличением амплитудыгидролитической и транспортной активности протонной помпы плазмалеммы;3. Установлено синхронное увеличение транскрипции генов, кодирующихсубъединицы Н+-АТФазы тонопласта, с усилением роста растяжением клетокгипокотилей этиолированных проростков арабидопсиса и суспензионнойкультуры табака VBI-0.4. Усиление транскрипции генов V-АТФазы коррелировало с увеличениемколичества белков субъединиц В и Е в составе вакуолярной мембраны, а такжес усилением гидролитической активности фермента клеток суспензионнойкультуры табака VBI-0.5.

Выявлено линейное снижение экспрессии генов, кодирующих Н+пирофосфатазутонопласта,соответствующееуменьшениюуровнясоответствующего белка в составе тонопласта клеток гипокотилейарабидопсиса и суспензионной культуры табака VBI-0, что коррелировало спонижением гидролитической активности фермента клеток табака в ходе ростарастяжением;6.

Установлено приоритетное значение Н+-пирофосфатазы тонопласта на этапезавершения деления и переходе к росту растяжением, которое сменяетсяусилением роли Н+-АТФаз как плазмалеммы, так и тонопласта, принимающихактивное участие в реализации роста растяжением растительных клеток.СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИПубликации в изданиях, рекомендованных ВАК:1. Чэнь Т., Михайлова Ю.В., Романюк Д.А., Шишова М.Ф. Тест-системавизуализации закисляющей способности клеток суспензионной культуры табака// Естественные и технические науки. 2015. № 12 (90). С. 11-15.2.

Кирпичникова А.А., Чэнь Т., Романюк Д.А., Емельянов В.В., Шишова М.Ф.Особенности регуляции вакуолярной Н+-АТФазы растительных клеток //Вестник С.-Петербургского ун-та. Сер. 3. 2016. Вып. 2. С. 149-160.3. Чэнь Т., Михайлова Ю.В., Шишова М.Ф. Молекулярно-филогенетическийанализ субъединиц Н+-АТФазы тонопласта // Экологическая генетика. 2015. Т.XIII, № 4. С. 76-90.Публикации в других изданиях:1. Чэнь Тинчжо, Прокопьева Ю.П., Емельянов В.В., Шишова М.Ф. Регуляцияактивности протонных помп плазмалеммы и тонопласта на транскрипционномуровне // Материалы Международной научной конференции «Физиология19растений - теоретическая основа инновационных агро- и фитобиотехнологий»,Калининград, 19-25 мая 2014.

Часть 1. С. 135-136.2. Shishova M., Prokopieva Ju., Chen T., Yemelyanov V. Is auxin involved inregulation of H+-pump activity at transcriptional level? // Book of abstracts of theInternational Symposium on Auxins and Cytokinins in Plant Development. Prague,June 29 – July 4, 2014. P. 142.3. Чэнь Т., Емельянов В.В., Романюк Д.А., Михайлова Ю.В., Шишова М.Ф.Изменение транскрипции генов, кодирующих Н+-АТФазы плазмалеммы итонопласта в ходе роста растяжением клеток суспензионной культуры табака //Тезисы докладов VIII Съезда общества физиологов растений России «Растенияв условиях глобальных и локальных природно-климатических и антропогенныхвоздействий», Петрозаводск, 21-26 сентября 2015 г. С.

440.4. Чэнь Т., Прокопьева Ю.П., Михайлова Ю.В., Емельянов В.В., Шишова М.Ф.Регуляция активности протонных помп плазмалеммы и тонопласта натранскрипционном уровне в ходе роста растяжением клеток табака // Тезисыдокладов III (XI) Международной ботанической конференции молодых ученыхв Санкт-Петербурге, 4-9 октября 2015 г. С. 85.5. Кирпичникова А.А., Чэнь Т., Михайлова Ю.В., Шишова М.Ф. Изменениегидролитической и транспортной функций протонной АТФазы плазмалеммы входе роста растяжением клеток табака суспензионной культуры VBI-0 //Материалы Годичного собрания общества физиологов растений России:Сигнальные системы растений: от рецептора до ответной реакции организма,СПб., 21-24 июня 2016, С. 117.6.

Чэнь Т., Михайлова Ю.В., Романюк Д.А., Емельянов В.В., Шишова М.Ф.Изменение активности протонной АТФазы тонопласта на транскрипционномуровне в ходе роста растяжением клеток табака суспензионной культуры VBI-0.// Там же, С. 143-144..