Автореферат (Регуляция активности протонных насосов растительной клетки в ходе роста растяжением), страница 3

Теплокарта изменения экспрессии генов, кодирующих субъединицывакуолярной Н+-АТФазы гипокотилей арабидопсиса, на 4, 6 и 9 сутки этиолированногоразвития. 1, 2, 3 – независимые биологические повторности.При сравнении накопления продуктов экспрессии генов, кодирующихсубъединицы периферического V1-комплекса вакуолярной Н+-АТФазы, выявленолидирующее значение субъединицы В, имеющей нуклеотид-связывающий сайт, новыполняющей в отличие от субъединицы А регуляторную функцию, а такжесубъединицы G2 и F (данные приведены в диссертации). Известно, что последниеиграют роль в сопряжении гидролиза АТФ и транспорта протонов.

Данные обэкспрессии генов субъединиц периферического V1-комплекса указывают, чтомаксимальным изменениям подвержена экспрессия генов, кодирующих с2 и с4изоформы субъединицы, отвечающей за образование протеолипидного кольца,локализованного в мембране (данные приведены в диссертации). Вращение скольца относительно субъединицы а осуществляет перемещение протонов черезмембрану. Накоплением транскриптов отличаются и гены, кодирующиесубъединицы d1 и d2. Субъединица d — единственная гидрофильная субъединицаинтегрального домена.

Она является частью центрального стержня V-АТФазы иважна для ротационного механизма фермента.В целом, характер изменения экспрессии субъединиц был свойственен и длякорня, однако эти изменения были гораздо меньшими по амплитуде. Тем не менее,можно выделить ряд специфичных генов для гипокотиля. К числу таковых можноотнести субъединицы: В, F, G2, H – V1 комплекса и c1-4, d1 и d2 – V0 комплекса.2.52.5*2**21.51.5110.50.50В Суб.44Днядня66 Днейдней**99 Днейдней0E Суб.Рис. 5. Анализ содержания субъединиц В и Е Н+-АТФазы тонопласта в составемикросомальной фракции с применением блот-анализа из клеток гипокотиля на 4, 6 и 9сутки этиолированного развития.11Результаты последующего анализа содержания субъединицы В и E в составемикросомальной фракции, полученной из клеток гипокотилей арабидопсисаразного возраста представлено на Рис.

5. Можно видеть, что обогащение фракцииданными субъединицами было наибольшим на 6 день развития.Полученные данные указывают на важные регуляторные процессы,происходящие в обоих доменах фермента и, по-видимому, вовлеченные винтенсификацию его работы при условии, что усиление экспрессиисопровождается накоплением соответствующего белка. Таким образом, для VАТФазы, также как и для протонной P-АТФазы плазмалеммы было свойственноувеличение экспрессии генов, кодирующих их или их субъединицы, а такженакопление соответствующих белков в составе мембран, на этапе интенсивногороста растяжением гипокотилей этиолированных проростков.Относительныйуровень экспрессии геновИзменение экспрессии генов, кодирующих Н+-пирофосфатазу тонопласта, впроцессе роста проростков арабидопсиса.Не менее важное значение в генерации протонного градиента на вакуолярноймембране играет протонная пирофосфатаза.

В геноме A. thaliana Н+-ПФазазакодирована тремя генами, но на тонопласте локализована только одна изизоформ — AVP1 (Mitsuda et al., 2001; Segami et al., 2010). Сравнительный анализэкспрессии этих генов выявил преимущественное накопление транскрипта AVP1на самом раннем из протестированных этапов развития, т.е. на 4 день прорастания(Рис. 6). В дальнейшем она в значительной степени снижалась.2211Дня.4 4дня**Дня.6 6дней**0Дня.9 9дней0AVP1AVP221.5144 Днядня****0.566 Днейдней99 Днейдней0Н+PPI-ПФазаРис. 6.

Изменение относительного уровня экспрессии генов Н+-ПФазы тонопласта вгипокотилях A. thaliana на 4, 6 и 9 сутки этиолированного развития и результаты блотанализа содержания фермента в составе микросомальной фракции клеток гипокотилейарабидопсиса.12Следует отметить, что изменение числа транскриптов гена AVP2 было не стользначительным, что позволяет заключить, что именно ген AVP1 подвергаетсярегулированию на транскрипционном уровне. Данное предположениеподкрепляется совершенно иной динамикой накопления транскриптов генов,кодирующих пирофосфатазы, в корнях проростков арабидопсиса в ходе развития.Последующий анализ накопления белка в составе везикулярной фракции,полученной из гипокотилей проростков арабидопсиса, выявил сходнуютенденцию. На Рис.

6 показано линейное снижение представленностипирофосфатазы в составе везикулярной фракции. Полученные данныесвидетельствуют о снижении физиологической значимости Н+-пирофосфатазы входе развития гипокотиля с интенсификацией роста растяжением.Таким образом, рост растяжением клеток этиолированных гипокотилейарабидопсиса сопровождается линейным снижением экспрессии гена,кодирующего вакуолярную пирофосфатазу, однако одновременно наблюдаетсянелинейное изменение экспрессии генов, кодирующих протонные АТФазы или ихсубъединицы. Тем самым, возможна регуляция работы протонных насосов натранскрипционном уровне.

Однако, гипокотили арабидопсиса представляют собойювенильный орган, который образован несколькими типами тканей. Клеткигипокотиля находятся на разных стадиях клеточного цикла и их синхронизацияневозможна. В качестве модельного объекта, удовлетворяющего условиюсинхронного развития и прохождения этапа роста растяжением, была выбранасуспензионная культура клеток табака VBI-0.Изменение экспрессии генов, кодирующих Н+-АТФазу плазмалеммы, впроцессе роста клеток суспензионной культуры табака VBI-0Н+-АТФаза плазмалеммы в клетках табака также кодируется мультигеннымсемейством. Проведенный анализ экспрессии показал, что большинство геновусиливают экспрессию на 2-ой неделе развития при наибольшей интенсивностироста растяжением (Рис.

8). Полученный результат соответствует приведеннымвыше данным, полученным на гипокотилях арабидопсиса, однако усилениеэкспрессии не столь значительно. Наиболее сильно активируемые гены (РМА 1-3)относятся к тому же подсемейству I, что и AHA4 и АНА11.Относительныйуровень экспрессии генов105**05*0PMA11051010**0105500PMA2PMA4PMA31010551 нед1Нед.***PMA62 нед2Нед.3 нед3Нед.00PMA5**PMA91395 КД1 нед2 нед3 нед12,5651,08732.521.510.50**11 Нед.нед22 Нед.нед33 Нед.недH+-ATPaseH+-АТФазаРис. 7. Изменение экспрессии генов Н+-АТФазы в ходе развития клеток суспензионнойкультуры клеток табака VBI-0 и результаты блот-анализа содержания фермента в составефракции плазмалеммы.

нед – здесь и далее неделя развития культуры.Увеличение накопления транскриптов четко соответствовало нелинейномунакоплению белка Н+-АТФазы плазмалеммы в очищенной везикулярной фракцииплазмалеммы (Рис. 7), что может свидетельствовать о регуляции активностифермента на транскрипционном уровне.Последующий анализ активности Н+-АТФазы ПМ выявил, что на 2 неделюразвития регистрируется почти 30% усиление суммарной гидролитическойфункции фермента (Рис. 8). Как известно, протонная АТФаза – это фермент,который одновременно осуществляет две функции: гидролитическую итранспортную.Аконтроль （вода）VBI-0Мертвые VBI-0VBI-0+VanABCABCABCABCDEFDEFDEFDEFGHIGHIGHIАВременныеинтервалы:GHIA-1 мин, B-15 мин, C-30 мин, D-45 мин, E-60 мин, F-75 мин, G-90 мин, H-105 мин, I-120 мин.В35pH6.0-ванатат- Ванадат30pH6.0+ванатат+Ванадат25201510501нед2нед3 недИнтенсивность окраски,ОД / пиксельА, мкМ Фн/мг белка/часБ25Нед.11 нед20Нед.22 нед15Нед.33 нед105мин0050100150Рис.

8. Изменение амплитуды гидролитической (Б) и ацидофицирующей (В) активностиклеток суспензионной культуры табака VBI-0 разного возраста. А –изменение окраски вовремени в контрольных и опытных вариантах, Б – гидролитическая активность, В –закисляющая активность. Van – ванадат, (8*10-4 M).14Для оценки второй составляющей был специально разработан метод оценкиацидофицирующей активности клеток суспензионной культуры табака.

На Рис. 8убедительно показано, что способность к закислению среды свойственна толькоживым клеткам и обусловлена работой Н+-АТФазой плазмалеммы, т.к.подавляется специфическим ингибитором – ионами ванадата. Полученные данныесвидетельствуют о том, что на 2 неделю развития максимальной амплитудыдостигает и ацидофицирующая активность фермента.Наряду с регуляцией работы Н+-АТФазы ПМ на транскрипционном уровненельзя исключить и регуляцию на пост-трансляционном уровне. Наиболеераспространенным видом пост-трансляционных модификаций Н+-АТФазыплазмалеммы, приводящих к изменению ее активности, являются процессыфосфорилированияидефосфорилирования(Gaxiolaetal.,2007).+Фосфорилирование С-концевого автоингибиторного домена Н -АТФазы приводитк активации фермента при участии регуляторных 14-3-3 белков. С-концевой доменв нефосфорилированном состоянии ингибирует активность Н +-АТФазы.Фосфорилированиеавтоингибиторногодоменапоконсервативномупредпоследнему аминокислотному остатку (Thr) и последующее присоединение14-3-3 регуляторных белков ведет к образованию гетерододекамера (6 молекул Н+АТФазы и 6 молекул белка 14-3-3) и возрастанию активности фермента.