Автореферат (1145744), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Выделение проводили при температуре +4оС. Навескурастительного материала гомогенизировали с использованием измельчителяMoulinex с добавлением среды, содержащей 0.25 М сорбит, 50 мМ Tris/MES (pH7.5), 1 мМ ЭГТА, 2 мМ ДТТ, и 1% (W/V) ПВП, 0.2% (W/V) БСА из расчета 30 гклеток на 50 мл среды. Гомогенат центрифугировали 10 минут при 7000 g нацентрифуге (MPW-350R). Далее супернатант 45 мин центрифугировали при100000 g на центрифуге Beckman Avanti J-30I.Получение везикулярной фракции плазмалеммы из клеток суспензионнойкультуры Nicotiana tabacum.
Осадок ОМФ переносили калий-фосфатным буфером(3 мМ KCl, 5 мМ КН2РО4/КОН, (рН 7,8) и 330 мМ сахарозы) в гомогенизаторПоттера, а далее наносили на подготовленную заранее двухфазную системуПЭГ/Декстран (Larson et al., 1984). После перемешивания полученную смесьцентрифугировали 3 минуты при 3500 об/мин в настольной центрифуге Т–23D.Верхнюю фракцию, содержащую ПЭГ и плазмалемму, переносили на новыйнижний слой.
Очистку повторяли трижды. После последнего центрифугированиясобранный верхний слой разбавляли в 3 раза средой (300 мМ раствор сахарозы на10 мМ буфере Tris–MES (pH 7.2)) и центрифугировали в течение 1 часа при100000 g. Полученный осадок везикул плазмалеммы ресуспендировали той жесредой. Чистоту фракции оценивали по результатам ингибиторного анализа.Получение везикулярной фракции тонопласта из клеток суспензионной культурыNicotiana tabacum. Гомогенизированную ОМФ наносили на подготовленнуюзаранее систему сахароза/сорбит (6,3%). После центрифугирования при 100000 g втечение 120 мин, везикулярную фракцию, обогащенную тонопластом, собирали награнице фаз. Фракцию разбавляли средой состава: 0,25 М сорбит, 20 мМ Tris/MES(рН 7,5), 1 мМ ЭГТА, 2 мМ MgCl2, и 2 мM ДТТ и центрифугировали при 100000 gв течение 45 мин.
Полученный осадок везикул тонопласта ресуспендировали тойже средой. Чистоту фракции оценивали по результатам ингибиторного анализа.Методы биохимического анализа. Для определения содержания белкаиспользовали микрометод М. Бредфорд (Bradford, 1976). Экстинкциюреакционной смеси измеряли на спектрофотометре SPECTRO STAR NANO придлине волны 595 нм. При построении калибровочного графика использовалираствор яичного альбумина на 150 мМ сахарозе в 10 мМ Tris/MES.Гидролитическую активность Н+-АТФазы везикулярной фракции плазмалеммыопределяли по количеству неорганического фосфата, образующегося в ходеферментативной реакции.
Реакционная среда содержала 90 мМ Tris/MES, 15 мМАТФ, 0,25 М КСl, 15 мМ МgCl2. Реакцию начинали добавлением мембранногопрепарата в пробирки с реакционной средой, которые выдерживали 30 мин при737°С на водяной бане. Реакцию останавливали (на ледяной бане) добавлением 50мкл 20% охлажденной трихлоруксусной кислотой. Содержание неорганическогофосфата определяли спектрофотометрическим способом (Lindeman, 1958).Определение закисляющей способности клеток Nicotiana tabacum. Анализацидофицирующей способности клеток суспензионной культуры проводили спомощью специально разработанного метода, основанного на использованииБромкрезолового пурпурового. В стерильные чашки Петри (диаметр 40 мм)добавляли по 4 мл приготовленной среды, которые содержали 10% растворбромкрезолового пурпурового, 0,7% агар (pH 7).
На поверхность агаризованнойсреды наносили 3 г клеток. Каждые 15 мин фиксировали изменение цветаиндикатора на сканере (HP scanjet G2710). Цветность изображения оценивали сиспользованием программы ImageJ.Оценка присутствия протонных помп в составе плазмалеммы и тонопласта.Детекцию протонных помп в составе соответствующих мембран проводили спомощью Вестерн-блотт анализа.
Белки разделяли электрофоретическим методом.Далее их переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Процедуру «мокрого»переноса белков осуществляли в течение 1 часа при 100 V и 250 mA в системеMini-PROTEAN (Bio-RAD) по протоколу производителя. Потом в течение ночимембрану инкубировали в растворе, содержащем первичные кроличьи антитела,специфичные для Н+-АТФазы плазмалеммы, субъединиц Н+-АТФазы тонопласта ивакуолярной Н+-ПФазы (Agrisera). Для визуализации использовали вторичныеантитела против иммуноглобулинов G (H+L) кролика, меченные пероксидазой (ГУНИИЭМ им.
Н.Ф.Гамалеи РАМН). После окрашивания мембрану сканировали.Оптическую плотность пятен, отражающую «наличие» протонных помп всоответствующих мембранах, анализировали с помощью компьютернойпрограммы PhotoM.Статистическая обработка результатов. Опыты проводили не менее, чем в 3-хбиологических и 3-х аналитических повторностях. Результаты обработаны впрограмме Excel 2010. На графиках представлены средние значения и ошибкасреднего.
Достоверности полученных различий определяли с использованиемметодов статистического анализа с применением ANOVA. На графиках звездочкипоказывают значимость различий при уровне 95% (*) и 99% (**).Результаты и обсуждениеОдной из широко используемых моделей для изучения процессов,сопровождающих рост растяжением, является этиолированный рост проростков(Holm, Key, 1969; Jacobs, Taiz, 1980; Рудашевская и др., 2002). К их числу можноотнести колеоптили злаков, в том числе кукурузы, т.к.
эти ювенильные органыимеют очень краткий период развития. На этом объекте ранее было показано, чтоН+-АТФаза плазмалеммы – ключевой фермент роста растяжением – нелинейноменяет свою активность с достижением максимума на этапе интенсивного роста(Рудашевская и др., 2002; Шишова и др., 2012). Другим модельным объектомявляются гипокотили этиолированных проростков арабидопсиса, геном которогополностью секвенирован (The Arabidopsis Genome Iniative, 2000).Проведенный анализ показал, что характер роста гипокотиля Arabidopsisthaliana изменяется нелинейно. Высокая интенсивность роста характерна длягипокотилей до 7 дня развития, после чего резко снижается, тогда как рост корня8был менее интенсивным и продолжался практически линейно.
В результате вкачестве ключевых для дальнейшей работы были выбраны временные точки 4, 6 и9 дней, соответствующие началу роста, его интенсивной реализации и завершению(Рис. 1).АБТочка выборки12 3 45 6 78 9 10ДНИТочка выборки12 3 45 6 78 9 10ДНИРис. 1. Изменение длины гипокотилей (А) и корней (Б) A. thaliana в ходе этиолированногоразвития.Относительный уровень экспрессии геновИзменение экспрессии генов, кодирующих Н+-АТФазу плазмалеммы впроцессе роста проростков арабидопсис.Известно, что Н+-АТФаза ПМ у A. thaliana кодируется семейством генов иэкспрессия этих генов имеет тканеспецифичный характер.
Однако, изменениеэкспрессии генов, кодирующих Н+-АТФазу ПМ, в ходе развития проростков доэтого момента проанализированы не были. Наши исследования показали, что 5генов семейства AHA характеризовались нелинейным увеличением накопленияпродукта с достижением максимума на 6 сутки, характеризующиеся интенсивнымростом. К числу изменяемых относится ген АНА1, продукты которогодетектируются по всему организму на всех этапах развития. Значительныеизменения были детектированы для АНА4, АНА9 и АНА11 (Рис.
2). Эти геныотносятся к разным подсемействам, обладают тканеспецифичной экспрессией, чтоможет указывать на их особое физиологическое значение.20**1510*2020201515151010105500** **520201515151010** *0*0AHA6044Дня.дня66Дня.дней599Дня.дней0AHA9AHA4**10**55AHA3205**0AHA2AHA1****AHA11Рис. 2. Интенсивность экспрессии генов, кодирующих различные изоформы Н+-АТФазыплазмалеммы в гипокотилях A. thaliana на 4, 6 и 9 сутки этиолированного развития.9295 КД**1.5дня4 Дня16 Днейдней9 Днейдней0.50+HH+-ATPase-АТФазаРис.
3. Анализ содержания Н+-АТФазы плазмалеммы в составе микросомальной фракции сприменением блот-анализа из клеток гипокотиля на 4, 6 и 9 сутки этиолированного развития.Здесь и далее в таблице и на гистограмме представлены оцифрованные значения,характеризующие площадь и оптическую плотность визуализированных пятен вторичныхантител.Усиление экспрессии, но меньшей амплитуды, было отмечено и для AHA1 иAHA11 в корне, однако нелинейное усиление экспрессии было специфичным длягипокотиля с максимумом на 6 сутки развития (данные приведены в диссертации).Подтверждение увеличения содержания белка Н+-АТФазы ПМ в ходе ростарастяжением гипокотилей проростков арабидопсиса было получено с помощьюВестерн-блот анализа и представлено на Рис. 3.
Максимальное значение выявленона 6 день, в период интенсивного роста клеток гипокотилей.Изменение экспрессии генов, кодирующих Н+-АТФазу тонопласта в процессероста проростков арабидопсиса.Процесс роста растяжением сопровождается значительным увеличениемразмеров центральной вакуоли, что может приводить к изменению состава исвойств компонентов тонопласта. Одним из наиболее значимых ферментоввакуолярной мембраны является вакуолярная Н+-АТФаза V-типа. Онапредставляет собой мультисубъединичный комплекс, включающий в себяпериферический (V1) и мембранный интегральный (Vo) домены. Некоторыесубъединицы тонопластной Н+-АТФазы закодированы единственным геном, анекоторые кодируются семейством.
Данные об изменениях экспрессии геновсубъединиц Н+-АТФазы тонопласта при росте растяжением на сегодняшний день влитературе не представлены.Первичный сравнительный анализ выявил, что в ходе роста растяжениемгипокотилей проростков A. thaliana меняется экспрессия большинства генов,кодирующих субъединицы вакуолярной Н+-АТФазы (Рис. 4).
Интересно, что длямногих генов показано увеличение накопления продукта не только на 6, но и на 9сутки развития гипокотиля, что косвенным образом может указывать наувеличение значимости этого компартмента клетки на более поздних этапахразвития клетки и проростка, в целом.104 дня6 дней9 днейРис. 4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
