Автореферат (Регуляция активности протонных насосов растительной клетки в ходе роста растяжением)

На правах рукописиЧЭНЬ ТинчжоРегуляция активности протонных насосов растительной клеткив ходе роста растяжением03.01.05 – физиология и биохимия растенийАвтореферат диссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург20172Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательномучреждении высшего образования «Санкт-Петербургский государственныйуниверситет»Научный руководитель: доктор биологических наукШишова Мария ФедоровнаОфициальные оппоненты:Минибаева Фарида Вилевна, доктор биологических наук,заведующая лабораторией окислительно-восстановительногометаболизма ФГБУН «Казанский институт биохимии ибиофизики Казанского научного центра РАН»;Озолина Наталья Владимировна, доктор биологических наук,заведующая лабораторией физиологии растительной клеткиФГБУН «Сибирский институт физиологии и биохимии растенийСибирского отделения РАН»Ведущая организация: ФГБУН Ботанический институт им.

В.Л.Комарова РАНЗащита состоится «____»________ 2017 г. в _____ на заседании диссертационногосовета Д 999.167.02 по защите кандидатских и докторских диссертаций при СанктПетербургском государственном университете по адресу: 199034, СанктПетербург, Университетская наб., д. 7/9, СПбГУ, Биологический факультет,аудитория _______.С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М.ГорькогоСанкт-Петербургского государственного университета и на сайте http://spbu.ru.Автореферат разослан «____»________2017 г.Ученый секретарьдиссертационного советаШарова Елена Игоревна3ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы. Одно из уникальных свойств растительных клеток,существенно отличающее их от животных, заключается в способности к ростурастяжением.

Согласно теории "кислого роста" ключевую роль в процессе ростарастяжением играет Н+-АТФаза плазмалеммы (ПМ). Активация этого ферментаобеспечивает выход протонов из клетки и индукцию изменения пластическихсвойств клеточной стенки. Показано изменение свойств Н+-АТФазы ПМ придействии целого ряда внешних и внутренних факторов. В настоящее времявыяснены структура и свойства Н+-помпы ПМ, а также основные пути регуляцииее активности на пост-трансляционном уровне.

Однако при расширении данных окодировании фермента, очень мало известно о регуляции на транскрипционномуровне. Например, до сих пор не ясно, каким образом регулируется работа этойпротонной помпы в ходе онтогенеза, в том числе в ходе роста растяжением.Многократное увеличение длины клетки сопровождается интенсивнойвакуолизацией, что обусловливается изменением осмотических градиентов междуцитоплазмой и вакуолью.

Одну из наиболее значимых транспортирующих системтонопласта представляет собой Н+-ATФаза вакуолярного типаширокораспространенный у эукариотических клеток протонный насос внутриклеточныхмембран. Она организована как мультисубъединичный комплекс, образованныйнадмембранным каталитическим и трансмембранным доменами. Показанозначительное изменение активности фермента в стрессовых условиях. Однакомеханизмы регуляции работы фермента, как на транскрипционном, так и посттрансляционном уровнях, еще практически не изучены.

Отсутствуют данные овозможности изменения активности данного протонного насоса в ходе ростаклетки. Еще один протон-транспортирующий фермент вакуолярной мембраны –Н+-пирофосфатаза (Н+-ПФаза). Она также участвует в генерации протонногоградиента на тонопласте, однако использует для этого энергию пирофосфата.Значительный интерес исследователей к изучению этого фермента позволилвыявить роль Н+-ПФазы в самых различных физиологических и адаптационныхпроцессах. В тоже время механизмы ее участия при вакуолизации клетки в ходероста растяжением остаются нераскрытыми.Перечисленные протонные насосы являются ключевыми элементами системырН-стата.

Активное поддержание уровня рН цитоплазмы в процессежизнедеятельности – неотъемлемое свойство живой клетки. Можно лишьпредполагать, что модуляция работы любой из протон-транспортирующих системможет инициировать изменение работы других.Цель работы заключается в исследовании активности протонных насосоврастительной клетки в ходе роста растяжением на транскрипционном уровне.В связи с этим были сформулированы следующие задачи исследования:1.Проанализировать интенсивность экспрессии генов, кодирующих Н+АТФазу плазмалеммы, Н+-пирофосфатазу тонопласта и субъединицы вакуолярнойН+-АТФазы в ходе роста растяжением клеток этиолированных проростковарабидопсиса и суспензионной культуры клеток табака VBI-0;2.Оценить изменение содержания белка Н+-помп в составе плазмалеммы итонопласта в ходе роста растяжением клеток гипокотилей этиолированных4проростков арабидопсиса и суспензионной культуры клеток табака VBI-0 спомощью Western blot-анализа;3.Выявить динамику гидролитической активности Н+-помп в составеплазмалеммы и тонопласта в ходе роста растяжением клеток суспензионнойкультуры табака VBI-0;4.Предложить модель перераспределения роли протонных насосоврастительной клетки в ходе роста растяжением.Научная новизна исследования.

Впервые для двух модельных объектов,представленных этиолированными гипокотилями арабидопсиса и суспензионнойкультурой клеток табака VBI-0 доказано нелинейное изменение активности Н+АТФазы плазмалеммы. Усиление гидролитической и транспортной активностифермента опосредовано усилением экспрессии нескольких генов семейств AHA уарабидопсиса и PMA у табака, и увеличением Н+-АТФаз в составе ПМ.Впервые для вакуолярной Н+-АТФазы клеток, растущих растяжением, выявленанелинейная динамика гидролитической активности, сопровождающаясяусилением экспрессии генов, кодирующих субъединицы фермента, увеличениемколичества этих субъединиц в составе тонопласта. Впервые проведенмолекулярно-филогенетический анализ субъединиц фермента, указывающий наразличия в путях эволюции вакуолярной протонной помпы.Установлено, что Н+-ПФаза тонопласта характеризуется постепеннымзатуханием гидролитической активности, обусловленным однонаправленнымизменением экспрессии генов, ее кодирующих, и представленностьюсоответствующих белков в составе тонопласта.Впервые для модельных объектов предложена модель перераспределения ролипротон-транспортирующих ферментов в ходе роста растяжением от Н+-ПФазы кН+-АТФазам.Теоретическая и практическая значимость.

Доказана важность регуляцииактивности протонных насосов растительной клетки в ходе роста растяжением натранскрипционном уровне. Впервые выявлена прямая корреляция динамикиэкспрессии с последующим изменением активности Н+-АТФаз и Н+-ПФазы.Проведен молекулярно-генетический анализ субъединиц и выявлены различия вэволюционных изменениях кодирования субъединиц Н+-АТФазы V-типа.Разработан уникальный метод оценки транспортной активности протоннойАТФазы ПМ суспензионной культуры табака VBI-0. Этот метод может бытьвостребован для экспресс-тестирования протон-транспортирующей (закисляющей)активности клеток различных суспензионных культур.Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, могут быть использованыв материалах курсов лекций, читаемых на биологическом факультете СПбГУ(«Сигнальные системы растений», «Физиология растительной клетки»).Основные положения, выносимые на защиту.

1. Протонные АТФазы ПМ итонопласта нелинейно изменяют свою активность с проявлением максимума наэтапе интенсивного роста растяжением; 2. Рост-обусловленное усиление работыпротонных АТФаз сопровождается усилением экспрессии генов, кодирующихферменты или их субъединицы, а также увеличением содержаниясоответствующих белков в составе мембран; 3. Значение протоннойпирофосфатазы тонопласта снижается в ходе роста растяжением.5Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены наМеждународной научной конференции «Физиология растений - теоретическаяоснова инновационных агро- и фитобиотехнологий», Калининград, 19-25 мая 2014г., International Symposium on Auxins and Cytokinins in Plant Development.

Prague,June 29 – July 4, 2014, VIII Съезде общества физиологов растений России«Растения в условиях глобальных и локальных природно-климатических иантропогенных воздействий», Петрозаводск, 21-26 сентября 2015 г., III (XI)Международной ботанической конференции молодых ученых в Санкт-Петербурге,4-9 октября 2015 г., Годичном собрании общества физиологов растений России«Сигнальные системы растений: от рецептора до ответной реакции организма»,Санкт-Петербург, 21-24 июня 2016 г.По теме диссертации опубликовано 3 статьи в журналах из перечня ВАК РФ ицитируемых в РИНЦ.Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 137страницах, состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы,результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, которыйвключает в себя 180 источников, в том числе 169 на иностранном языке.Диссертация иллюстрирована 50 рисунками и 13 таблицами.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериалы и методы исследованияМодельными объектами работы являются этиолированные проростки Arabidopsisthaliana дикого типа, а также суспензионная культура, полученная из клетоксердцевины растений Nicotiana tabacum L.

(VBI-0-культура, Virginia Bright, Italia),характеризующаяся стадией роста растяжением в своем клеточном цикле.Условия выращивания. Стерильные семена A. thaliana высаживали наминеральную среду Мурасиге и Скуга (в концентрации 2,2 г/л) с добавлениемсахарозы (5 г/л) и агара (8 г/л), pH среды 5,7-5,8. В чашки Петри (диаметр 100 мм)добавляли по 30 мл стерильной среды, остужали, высаживали по 50 семян.Растения выращивали вертикально в темноте при комнатной температуре.Суспензию VBI-0 культивировали в темноте, при температуре 26оС ипостоянном перемешивании на ротационном шейкере (120 оборотов в минуту).Пересадку суспензионной культуры на свежую среду проводили через 3 недели(Zazimalova et al., 1993).Молекулярно-биологические методы.

Получение ДНК и РНК, а также получениекДНК проводили согласно рекомендациям производителя (Bio-Rad, Fermentas,Thermo Scientific).Дизайн праймеров для амплификации. Ряд праймеров был получен излитературных источников (Таблица приведена в тексте диссертации). Для дизайнаостальных праймеров, в первую очередь для Nicotiana tabacum, была использованапрограмма VECTOR NTI 11.5.1 и Beacon Designer 7. Последовательности геновбыли получены из базы данных NCBI (National Center for BiotechnologyInformation Search database – www.ncbi.nlm.nih.gov).

Качество праймеровоценивали с помощью ПЦР, которую проводили на амплификаторе C 1000 Touch6(Bio-Rad), с последующей визуализацией посредством разделения продуктов в 1%агарозном геле с добавлением этидия бромида (1%).Количественный анализ экспрессии генов с помощью ПЦР с детекцией в реальномвремени проводили с помощью системы Bio-Rad CFX96 REAL-TIME System сиспользованием коммерческого набора детекции iQ SYBR Green Supermix.Количественная оценка экспрессии рассчитана по сравнению с уровнемэкспрессии референсного гена - убиквитина. Предварительно показано отсутствиеизменений экспрессии гена сравнения в ходе роста растяжением.Получение общей микросомальной фракции (ОМФ) из Nicotiana tabacum иArabidopsis thaliana.