Отзыв официального оппонента 2 (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы)

отзыв официального оппонента на диссертационную работу Шмурака Владимира Игоревича на тему «Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы» на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.01.04 «Биохимия» Актуальность темы, То, что сывороточный альбумин выполняет транспортные функции, известно довольно давно, но ферментативная активность аль бумина — феномен малоизвестный и даже немного экзотический. Однако логика эволюции состоит в том, что, с одной стороны, любой высокоспециализированной структуре, будь то молекула, клетка или орган, предшествуег структура с низкой специализацией.

С другой стороны, высокая специализация связана с риском гибели системы при более или менее значительном отклонении от стационарных условий. Устойчивость неравновесных систем обеспечивается оптимальным соотношением высоко- и низкоспециализированных структур, каждая из которых дополняет или даже заменяет другую при значительных флуктуациях условий окружающей среды. Если мы будем помнить об этих простых базовых принципах эволюции, то представления и рассуждения о ферментатнвной активности альбумина уже не будут казаться далекими от реальных проблем современной биологии и медицины. Изучение этой активности никогда не было приоритетом большой науки, но приоритеты далеко не всегда соответствуют реальной значимости и актуальности той или иной проблемы. В этой «неприметной» области исследований накопилось довольно много интересных фактов.

Установлено, что альбумин выполняет целый ряд ферме нтативных функций: помимо карбоксилэстеразной активности альбумину присущи функции арилэстеразы, арилациламидазы, тиоэстеразы, супероксиддисмутазы, простагландин В-синтазы, глюкуронидазы, енолазы, ацетилсалицилат-деацетилазы, функции тиолпероксидаз (глутатион- и цистеинпероксидазы), а также группы фосфатаз (к н им относятся фосфомоноэстераза, фосфодиэстераза и подкласс фосфотриэстераз, представленный арилдиалкилфосфатазой, или параоксоназой, и диизопропилфторфосфатазой).

Следует отметить и прооксидантные свойства альбумина: связанные с альбумином ионы меди Сп~' усиливают образование аскорбат-радикала, молекулярный кислород и протоны окисляют образовавшиеся при этом ионы Сп' вновь до Сип+. Конечно, почти все эти виды активности альбумина невысоки, но его низкая активность компенсируется его высоким содержанием в плазме. Здесь следует отметить одну из недавних работ, свидетельствующих о тесной взаимосвязи уровня альбумина, наряду с уровнем орозомукоида, липопротеидов очень низкой плотности и цитрата, с вероятностью летального исхода для больных вне зависимости от характера их заболевания ~Р1зсЬег е1 а1., 2014).

Так что настало время для существенной переоценки роли альбумина, но оказалось, что практически ничего не известно о межвидовых отличиях, а ведь это важно как с теоретической, так и с практической точек зрения: если они существуют, то их необходимо учитывать при проведении экспериментальных исследований, доклинических и клинических испытаний. Тот факт, что в плазме крови человека нет карбоксилэстераз, а в плазме крови грызунов карбоксилэстераз очень много, имеет огромное значение при проведении лабораторных исследований.

В плазме крови быка также отсутствуют карбоксилэстеразы, но как раз бычий альбумин является наиболее популярным вследствие своей дешевизны компонентом буферных систем и растворов для перфузии. Совокупность этих и других фактов определяет высокую актуальность темы диссертационного исследования В.И. Шмурака. Обоснованность научных положений и выводов.

Цель работы состояла в исследовании ~п пп.о и ~п яйсо связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы. Научные положения, выносимые на защиту, так же как и выводы, сформулированные по результатам диссертационного исследования, обоснованы и логично связаны с целью исследования и полученными данными. Обоснованность положений и выводов диссертации подкрепляются большим по объему и значительным по содержанию материалом исследования с использованием современных биофизических и биохимических методов исследования, а также математического аппарата в тесной связи с глубокой аналитической проработкой полученных данных.

Научная новизна. На основании глубокого анализа литературы, а также результатов собственных биохимических исследований ш п~ю в сочетании с данными молекулярного моделирования и ийсо предложена и обоснована математическая модель для описания эстеразной активности альбумина.

В результате проведенного исследования определены кинетические и равновесные константы трех видов аль бумина ~быка, человека и крысы) с использованием биохимических методов в сочетании с методами молекулярного моделирования. В экспериментах и ий"о биохимическими методами установлено, что сайт Садлоу 1 альбумина крысы обладает максимальной каталитической эффективностью по отношению к пнитрофенилацетату, тогда как сродство сайта Садлоу П бычьего альбумина к и-нитрофенилацетату выше по сравнению с альбумином крысы и человека. В то же время, по отношению к параоксону каталитическая эффективность сайта Садлоу! максимальна у бычьего альбумина, в десятки раз превышая каталитическую эффективность альбумина крысы и человека.

Эти данные, а также данные, полученные с применением специфических ингибиторов, убедительно доказывают, что характеристики сывороточного альбумина крысы и человека гораздо ближе между собой, но существенно отличаются от характеристик бычьего альбумина. Кроме того, установлено, что фосфор илиро ванне сайта С~длоу П всех трех видов аль бумина при взаимодействии с параоксоном происходит быстрее ацетилирования этих сайтов. Дополнительные исследования кинетики взаимодействия с альбумином высокотоксичного зомана с применением метода косвенной оценки активности альбумина через определение остаточного ингибирования ацетилхолинэстеразы позволили диссертанту высказать предположение о преимуптесшенно транспортныых функциях сайта Садлоу П при токсикологячесии релевантных кОнцентрациях ж~мана.

Методами и кйсо изучены процессы взаимодействия альбумина с инитрофенилацетатом, параокс оном, стереоизом срами зомана, специфическими ингибиторами сайтов Садлоу 1 и П. Установлено, что фосфорорганические соединения - в частности, Р(-) изомеры зомана, обусловливающие его высокую токсичность, и оптически неактивный параоксон - могут продуктивно взаимодейспювать с сайтом Садлоу 1 альбумина; помимо Туг150 и Туг411 альбумина человека, с зоманом могут продуктивно взаимодействовать Зег193 и 1,уз402.

В то же время, данные молекулярного моделирования свидетельствуют о более высоком сродстве нетоксичных Р~+) изомеров зомана к Туг411 в сайте Садлоу П. Анализ реципрокного влияния основных сайтов альбумина при взаимодействии с негидролизуемыми лигандами - ибупрофеном и варфарином - позволил установить высокую селективность ибупрофена к сайту Садлоу П, но низкую селективность варфарина к сайту Садлоу 1. Достоверность полученных результатов. Диссертант в своей работе применил как традиционные, так и современные методы биохимического анализа, с использованием информации, полученной из специализированных баз данных.

Данные экспериментальных исследований, проведенные на высоком методологическом уровне, в сочетании с современными методами статистического анализа позволили обеспечить высокую степень достоверности полученных результатов, положений и выводов. Значимость для науки и практической деятельности. Проведенный автором сравнительный анализ альбуминов разных видов животных и выявленные структурно-функциональные особенности открывают возможность для более грамотного планирования экспериментальных исследований, в том числе доклинических испытаний, адекватной оценки экспериментальных данных с учетом видовой специфики.

Поскольку функциональные характеристики альбумина крысы и человека ближе между собой, в экспериментальных моделях и про необходимо использовать альбумин человека, а не более дешевый бычий альбумин. А при работе ех что с плазмой или сывороткой грызунов необходимо использовать ингибиторы карбоксилэстераз. Предложенная схема и математическая модель для описания эстеразной активности альбумина позволяет описывать сложные с функциональной точки зрения ферменты или квазиферменты, имеющие в своей структуре несколько разных сайтов, обладающих ферментатив ной или псе вдоферментативной активностью. Автор внес существенный вклад в разработку и совершенствование методологии сочетанного анализа ш з111со и ш л1го, что позволит всесторонне и более полноценно исследовать белковые структуры, проводить доклинические исследования фарм препаратов, находить способы направленного воздействия на определенные сайты или молекулу альбумина экзогенными и эндогенными лигандами, повышая эффективность терапии.

Результаты диссертационного исследования В.И. Шмурака могут быть использованы в других научных учреждениях, которые занимаются разработкой лекарственных препаратов, их испытанием, а также вопросами безопасности и гигиенического регламентирования. Среди них Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России, Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ, Институт экспериментальной медицины, НИИ фармакологии им. В.В. Закусова, Институт токсикологии ФМБА России, Военно-медицинская академия им. С.М.