Диссертация (Структура острова патогенности XII стрептококков группы В), страница 8

Обе пробирки с клеткамиинкубировали последовательно во льду в течение часа, в течение 2 минут при4642°С и затем в течение 5 минут во льду. К клеткам добавили по 1 мл LB бульона иинкубировали при 37°С в течение часа. Клетки высевали на чашки сантибиотиком.2.2.10 Схема создания слитой конструкцииДля создания слитой конструкции были подобраны специфические праймерына гены sspB1, erm с использованием программы Primer 3.0: праймер 1, праймер 2,праймер 3, праймер 4, праймер 5, праймер 6. Праймеры 1, 2 были подобраны кгену sspB1, а праймеры 5, 6 – к гену устойчивости к эритромицину (erm).Праймеры 3 и 4 являются составными:подчеркнутыми буквами обозначеныпоследовательности, комплементарные гену erm, а строчными – гену sspB1(таблица 1).14sspB1352erm6Рисунок 5 – Схема создания слитой конструкции генов sspB1 и erm2.2.11 СеквенированиеСмесь для секвенирующей ПЦР:Н2О до объема 20 мклДНК 0,5-11 мкл47Праймер 3,2 pmol/ml 1 мклDTCS 8 мклУсловия для постановки ПЦР1) 1 цикл – денатурация 96°С 3 мин2) 30 цикловa) Денатурация 96°С 20 секb) Отжиг праймеров 50°С 20 секc) Элонгация 60°С 4 мин3) 1 цикл – синтез 60°С 10 минПЦР проводилась в амлификаторе C1000 без добавления минеральногомасла.

После ПЦР к каждой пробу добавляли 5 мкл Stop solution.Stop solution: 2 мкл 3M ацетата натрия рН=5,2, 2 мкл10mM EDTA рН=8,0, 1 мклгликогена 20 мг/мл.Подготовка проб для секвенирования:1) Добавление 60 мкл стерильного 96% этанола.2) Центрифугирование при 4°С в течение 30 мин при 14000 об/мин.3) Отмывка осадка 200 мкл стерильного 70% спирта 2 раза.4) Центрифугирование при 4°С в течение 5 мин при 14000 об/мин.5) Высушивание осадка происходило в течение 15 мин при 25°С в вакуумносушильном шкафе.6) Растворение осадка в 40 мкл SLS.Процесс секвенирования проводился в секвенаторе GEXP.483 Результаты исследования3.1 Определение серотипов СГВ с помощью мультиплексной ПЦРСеротипы СГВ штаммов из России, США, Германии оценивали с помощьюмультиплекснойПЦРнагеныкапсульногооперона[90].Результатымультиплексной ПЦР со штаммами из Германии представлены на рисунке 6.1, 3, 4, 7, 9, 10 – мультиплексная ПЦР I со штаммами 26, 271, 281, 285, 884, 1009соответственно;2, 5, 8, 11 – мультиплексная ПЦР II со штаммами 26, 281, 285, 1009соответственно;6 – маркер молекулярного веса 100-1000, 1500 н.п.Рисунок 6 – Определение серотипов СГВ с помощью мультиплексной ПЦРМультиплексная ПЦР I дала положительный ответ со штаммами 26, 271, 281,884, 1009, а II – 285.

Размеры амплификатов со штаммами 26, 271, 281 – 1826 н.п.,884 – 521 и 1826 н.п., 1009 – 397 н.п., 285 – 701 н.п., таким образом, штаммы 26,271, 281 были отнесены к III серотипу, 884 – Ia, 1009 – II, 285 – V.Серотипы штаммов из Чешской республики, Великобритании, Португалиии Анголы были известны ранее.Распределение 235 штаммов из названных регионов по серотипампредставлено на рисунке 7. 37 штаммов были отнесены к серотипу Ia, 25 – к Ib, 31– ко II, 56 – к III, 34 – к IV, 18 – к V, 1 – к VI, 1 – к VII, 1 – к VIII. 31 штаммоказался нетипируемым данным методом.49353025ВеликобританияГермания20ПортугалияРоссия15СШАЧешская республика10Ангола50IaIbIIIIIIVVVIVIIVIIINTРисунок 7 – Серотипы штаммов СГВ3.2 Молекулярно-генетическая организация и распространенностьострова патогенности XIIГен поверхностного адгезина sspB1 в штамме O9OR СГВ был обнаружен в2004 году методом вычитающей гибридизации [119].

Оказалось, что данный генвстречается в геноме наиболее вирулентных штаммов [4; 41]. Анализ штаммовСГВ, депонированных в базе данных NCBI, показал, что ген, гомологичныйsspB1, был обнаружен ранее в геноме полностью просеквенированного штаммаNEM316 на острове патогенностиXII. Остров патогенности XII штаммаNEM316, по литературным данным, начинается с гена gbs1296, а заканчиваетсягеном gbs1373 [51].

Для оценки распространенности острова патогенности средиштаммов стрептококков группы В были определены предполагаемые функции 81открытой рамки считывания в геноме штамма NEM316 с помощью геномной базыданных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и компьютерной программы blastx50(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) (поиск белков по транслируемой нуклеотиднойпоследовательности). 78 генов были локализованы на острове патогенности XII, а3 гена – за его пределами (таблица 3, рисунок 8). Также был определен размергенов, рамки считывания и их G+C состав.Таблица 3 – Гены острова патогенности XII штамма NEM316№ генаРазмерРамкагена,считывани составн.п.я генагена, %gbs1296 1341-134,8Белок из семейства MATEgbs1297 411-135,8КонсервативныйG+CПредполагаемыйбелок,кодируемый данным геномгипотетическийбелок из семейства глиоксилазgbs1298 498-135,4Гипотетический белокgbs1299 657+131,2Липопротеинgbs1300 291+139,2ISSag4, транспозаза orfAgbs1301 780+141,2ISSag4, транспозаза orfBgbs1302 293+336,5Транспозазаgbs1303 381+134,9IS861, транспозаза OrfBgbs1304 261+134,6Транспозаза OrfB, IS3 семействоgbs1305 234+129,2Транспозаза OrfB, IS3 семействоgbs1306 2469-140,5Стрептококковый HIT белокgbs1307 916-140,7Ламинин-связывающий белокgbs1308 3520-341,7С5а-пептидазаgbs1309 1212-130,9Консервативныйгипотетическийбелокgbs1310 291+139,3ISSdy1, транспозаза OrfAgbs1311 837+140,3ISSag4, транспозаза orfBgbs1312 1815-127,0ДНК полимераза III субъединицаepsilon51Продолжение таблицы 3№ генаРазмер РамкаG+CПредполагаемыйгена,считываниясоставкодируемый данным геномн.п.генагена, %+125,2gbs1313 1236Консервативныйбелок,гипотетическийбелокgbs1314 1182-136,1Сайт-специфическая рекомбиназаиз семейства фаговых интегразgbs1315 204-134,5Гипотетический белокgbs1316 567-135,2Белок, участвующий в репликацииплазмидыgbs1317 309-139,6Мембранный белокgbs1318 309-133,7Мембранный белокgbs1319 573-136,9АТФаза из семейства FtsK/SpoIIIEgbs1320 504-137,5АТФаза из семейства FtsK/SpoIIIEgbs1321 315-140,0Гипотетический белокgbs1322 1206-129,0Гипотетический белокgbs1323 492-132,4Гипотетический белокgbs1324 3612-134,8РестриктазатипаIIGиметилтрансферазаgbs1325 1200-135,3Сайт-специфическая рекомбиназаиз семейства фаговых интегразgbs1326 318-134,0Гипотетический белокgbs1327 222-131,8Транскрипционныйрегулятор,ассоциированный с фагомgbs1328 894-132,6LacXgbs1329 1407-139,86-фосфо-β-галактозидаза LacG52Продолжение таблицы 3№ генаРазмер РамкаG+CПредполагаемыйгена,считываниясоставкодируемый данным геномн.п.генагена, %-141,2gbs1330 1707белок,Фосфотрансферазнаясистема,специфичная для лактозы, IIВCкомпонент LacEgbs1331 318-145,8Лактозо-специфическаяфосфотрансфераза LacFgbs1332 855-135,2Транскрипционныйантитерминатор LacTgbs1333 981-144,0Тагатозо-1,6-дифосфатальдолазаLacDgbs1334 930-142,8Тагатозо-6-фосфат киназа LacCgbs1335 516-142,5Галактозо-6-фосфатизомераза,субъединица LacBgbs1336 426-145,3Галактозо-6-фосфатизомераза,субъединица LacАgbs1337 756-139,7Репрессорфосфотрансферазнойсистемы лактозы LacRgbs1338 1878-133,9Релаксазаgbs1339 366-135,3Белок,необходимыймобилизации (Tn5252, Orf 9)gbs1340 360-134,9Транспозон Tn5252gbs1341 2019-128,6Геликазаgbs1342 2241-128,4АТФ-зависимая эндонуклеазаgbs1343 771-140,6zeta токсинgbs1344 477-138,2epsilon антитоксинgbs1345 291-137,2Гипотетический белокдля53Продолжение таблицы 3№ генаРазмер РамкаG+CПредполагаемыйбелок,гена,считываниясоставкодируемый данным геномн.п.генагена, %gbs1346 390-139,8Гипотетический белокgbs1347 231-142,5Гипотетический белокgbs1348 1086-139,8Белок Zn-fingergbs1349 639-138,6Гипотетический белокgbs1350 300-135,0Гипотетический белокgbs1351 300-140,5Гипотетический белокgbs1352 6201-140,8Метилтрансферазаgbs1353 594-141,0Геликазаgbs1354 552-138,2Гипотетический белокgbs1355 192-143,7Белок, связывающий кальцийgbs1356 4905-141,5Поверхностный адгезин sspB1gbs1357 591+132,5Белок абортивной инфекцииgbs1358 849+131,4Белок абортивной инфекцииgbs1359 2796-142,8Компонент системы секреции IVCVirB1-likegbs1360 2346-140,5Компонент системы секреции IVCVirB4gbs1361 354-140,4Гипотетическийбелоксистемысекреции IV типаgbs1362 855-142,0Компонент системы секреции IVCVirB6gbs1363 243-146,6Гипотетический белокgbs1364 1818-142,3Компонент системы секреции IVCVirD4gbs1365 489-143,2Гипотетический белок54Продолжение таблицы 3№ генаРазмер РамкаG+CПредполагаемыйбелок,гена,считываниясоставкодируемый данным геномн.п.генагена, %gbs1366 582-139,8Гипотетический белокgbs1367 234-139,2Гипотетический белокgbs1368 387-137,4Гипотетический белокgbs1369 447-139,4Гипотетический белокgbs1370 1353-144,5ДНК-метилтрансферазаgbs1371 423-145,4ДНК-метилтрансферазаgbs1372 816-139,3Белок-инициатор репликацииgbs1373 174-138,0Гипотетический белокgbs1374 366-139,2рибосомный белок 50S L7/L12gbs1375 501-138,1рибосомный белок 50S L10gbs1376 2109+137,8АТФ-зависимая Clp протеаза55Рисунок 8 – Генетическая организация острова патогенности XII56На острове патогенностиXII были локализованы гены факторовпатогенности: scpB, lmb, sspB1, гены лактозного оперона, системы токсинантитоксин,транспозазы,интегразы,релаксазы,системыхромосомнойсегрегации, системы абортивной инфекции, метилтрансферазы, система секрецииIVC типа.

Наибольшее внимание было обращено на гены острова вокруг генаsspB1 (gbs1356), так как была обнаружена корреляция между наличием данногогена и инфекцией урогенитального тракта [1]. Гены gbs1359, gbs1360, gbs1362,gbs1364, по литературным данным, относятся к компонентам системы секрецииIVC типа, характерной для грамположительных бактерий [130]. G+C составбольшинства генов острова отличался от G+C состава, характерного для СГВ.Сцельюопределенияраспространенностииорганизацииостровапатогенности, ассоциированного с геном sspB1, для дальнейшего исследованиябыли выбраны следующие гены: gbs1343, gbs1348, gbs1352, gbs1356 (sspB1),gbs1360, gbs1364, gbs1376.

Данные гены кодируют следующие белки: zeta токсин,белок Zn-finger, метилтрансферазу, SspB1, компонент системы секреции IVCVirB4, компонент системы секреции IVC VirD4, АТФ-зависимую протеазу. Генgbs1376 локализован за пределами острова патогенности, поэтому был выбран вкачестве положительного контроля ПЦР. Присутствие острова патогенности XII вгеномах штаммов оценивали по наличию генов, локализованных на острове иприлежащих к гену sspB1. Для детекции выбранных генов в штаммах СГВ былисконструированы праймеры, которые представлены в таблице 1. С помощью ПЦРбыло определено, что в геноме O9OR штамма присутствуют все гены, выбранныедля первичного анализа.На следующем этапе работы был проведен анализ остальных штаммов СГВ,выбранных для исследования.

С помощью полимеразной цепной реакциипроанализирована распространенность исследуемых генов в геномах штаммов изРоссии (Санкт-Петербурга), а также из ряда зарубежных стран (таблица 4). Генgbs1376, кодирующий АТФ-зависимую Clp протеазу, локализованный запределами острова, присутствовал в геномах всех штаммов из России. Геныострова патогенности были обнаружены в геномах 16 из 113 штаммов из России.57Однако у 5 штаммов отсутствовали ген gbs1343, кодирующий zeta токсин, и генgbs1364, кодирующий компонент VirD4 системы секреции IVC, а у одногоштамма не было обнаружено гена gbs1352, кодирующего метилтрансферазу, игена gbs1364, кодирующего компонент VirD4 системы секреции IVC.