Диссертация (Структура острова патогенности XII стрептококков группы В)

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение"Институт экспериментальной медицины"На правах рукописиКулешевич Евгения ВладимировнаСтруктура острова патогенности XII стрептококков группы В03.02.03 – микробиологияДиссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наукНаучный руководитель: Суворов А.Н.,профессор, д.м.н.Санкт-Петербург20152Оглавление2Введение ........................................................................................................................... 41 Обзор литературы....................................................................................................... 111.1Стрептококки группы В ....................................................................................................................................

111.1.1 Заболевания, вызванные стрептококками группы В .................................. 111.1.2 Факторы патогенности стрептококков группы В ....................................... 131.2 Мобильные генетические элементы ..................................................................................................................... 191.2.1 Виды мобильных генетических элементов и способы их передачи ........ 191.2.2 Мобильные генетические элементы стрептококков группы В ................. 231.3 Острова патогенности ........................................................................................................................................... 251.3.1 Общая характеристика островов патогенности ..........................................

251.3.2 Острова патогенности стрептококков группы В ........................................ 291.4 Заключение по обзору литературы ................................................................. 322 Материалы и методы.................................................................................................. 352.1 Материалы исследования ........................................................................................................................................ 352.1.1 Характеристика используемых материалов ................................................

352.1.2 Оборудование ................................................................................................. 362.1.3 Объекты исследования .................................................................................. 372.2 Методы исследования ..............................................................................................................................................

382.2.1 Компьютерный анализ................................................................................... 382.2.Выделение геномной ДНК фенол-хлороформным методом........................ 382.2.3 Выделение геномной ДНК набором ДНК-экспресс................................... 392.2.4 Полимеразная цепная реакция......................................................................

392.2.5 Мультиплексная полимеразная цепная реакция......................................... 432.2.6 Масс-спектрометрия штаммов стрептококков группы В .......................... 442.2.7 Рестрикция ДНК............................................................................................. 452.2.8 Лигирование ДНК .......................................................................................... 452.2.9 Трансформация кишечной палочки ............................................................. 452.2.10 Схема создания слитой конструкции .........................................................

462.2.11 Секвенирование............................................................................................ 463 Результаты исследования .......................................................................................... 483.1 Определение серотипов СГВ с помощью мультиплексной ПЦР .......................................................................... 483.2 Молекулярно-генетическая организация и распространенность острова патогенности XII...................... 4933.3 Статистическая обработка результатов ПЦР с штаммами на гены острова патогенности,ассоциированного с геном sspB1.................................................................................................................................... 593.4 Масс-спектрометрический анализ штаммов стрептококков группы В..........................................................

613.5 Создание рекомбинантных конструкций для экспрессии и инактивации гена sspB1 ...................................... 633.6 Сравнительный анализ белков SspB1 и SspB1a с гомологичными белками других микроорганизмов ........... 693.7 Определение распространенности гена sspB1a ...................................................................................................

713.8 Определение области интеграции острова патогенности, ассоциированного с геном sspB1 ..................... 723.9 Сравнительный анализ острова патогенности, ассоциированного с геном sspB1, с островомпатогенности, ассоциированным с геном sspB1a ......................................................................................................

833.10 Анализ штаммов из Португалии и Анголы на наличие генов, ассоциированных с геном sspB1a ................. 854 Обсуждение ................................................................................................................. 88Заключение .................................................................................................................... 95Выводы ...........................................................................................................................

97Список сокращений ...................................................................................................... 98Список литературы ....................................................................................................... 994ВведениеАктуальность темыСтрептококки группы В (СГВ) или Streptococcus agalactiae, впервыевыделенные у коров, больных маститом, длительное время рассматривалисьисключительно как возбудители заболеваний животных. И лишь начиная с 90-хгодов XX века для научного сообщества стало очевидным, что СГВ способнывызывать тяжелые инфекции у человека [14].

Большинство исследователейотносят эти бактерии к условно-патогенным микроорганизмам [6], которыевызывают в определенных условиях целый ряд заболеваний [14]. Инфекция СГВу беременных может приводить к тяжелым патологиям новорожденных в формесепсиса, менингита и пневмонии. Смертность новорожденных при развитиизаболеваний достигает 4-6%[128].

СГВ также являются причиной многихзаболеваний взрослых людей, а именно пневмонии, перитонита, артрита,менингита,эндокардита,абдоминальногоабсцесса,кистозногофиброза,некротизирующего фасциита, инфекций урогенитального тракта, кожи, мягкихтканей и костей [46; 62; 86; 92; 115; 116; 117; 118].Установлено, что СГВ вызывают заболевания у самых различных видовмлекопитающих: крупного рогатого скота, собак, кошек, слонов, кур, верблюдов,лошадей,обезьян,нутрий,хомяков,мышей,морскихмлекопитающих,крокодилов, лягушек и различных рыб [32, 34, 92,100]. Таким образом, СГВобладают способностью колонизировать различные экологические ниши иявляются причиной развития инфекционного процесса как у людей, так иживотных, что во многом обусловлено особенностями генетической организациистрептококков группы В, содержащих в геноме множественные мобильныегенетические элементы.Мобильные генетические элементы (плазмиды, транспозоны, бактериофаги иострова патогенности) вносят существенный вклад в формирование вирулентногофенотипа патогенных микроорганизмов.

Острова патогенности характеризуются5целым рядом структурных и генетических особенностей, в частности, наличиемгенов патогенности и генов, кодирующих системы секреции [17, 66]. Они могутмигрировать как в пределах одного генома, так и участвовать в генетическомобмене. Острова патогенности участвуют в эволюции бактерий, способствуявыживанию микроорганизма в организме хозяина. Миграция островов приводит кобразованию высоковирулентных эпидемических штаммов бактерий за счетполучения генов патогенности от других бактерий.

На острове патогенности XIIСГВ локализован ген sspB1, кодирующий поверхностный адгезин, относящийся ксистеме секреции V типа, а также кластер генов, кодирующих систему секрецииIV типа. Высказано предположение, что продукты генов sspB семейства влияютна развитие внутриутробной инфекции в организме плода или новорожденныхдетей и могут способствовать адгезии СГВ к эпителию мочеполового тракта [4;41]. Присутствие гена sspB1, а также генов других факторов патогенности наданном острове патогенности может усиливать вирулентность СГВ, способствуяформированию эпидемически актуальных штаммов.

Однако информации оборганизации данного острова патогенности и его распространенности средиштаммов СГВ в научной литературе недостаточно. Учитывая тот факт, что островпатогенности XII по всем имеющимся признакам относится к мобильнымгенетическим элементам, способным влиять на степень патогенности бактерии, внастоящей работе была поставлена задача изучения распространенности иорганизации острова патогенности XII в геноме стрептококков группы В.Степень разработанности темыСтрептококки группы В обладают широким набором различных факторовпатогенности, что определяет различия в вирулентности отдельных штаммов, приэтом многие гены, кодирующие факторы патогенности, локализованы намобильныхгенетическихэлементах.Полногеномноесеквенированиестрептококков группы В позволило установить, что в состав генома этих бактерийпомимо «коровой» части входят разнообразные мобильные генетические6элементы.