Диссертация (Структура острова патогенности XII стрептококков группы В), страница 7

Клетки инкубировали при 37°С в течение ночи. Культуруцентрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут при комнатнойтемпературе. Осадок ресуспендировали в 500 мкл ТЕ буфера (Трис-HCl 10mM,pH=8,0, ЭДТА 1 mM pH=8,0), содержащего 1 мг лизоцима. Клетки инкубировалипри 37°С в течение часа при периодическом перемешивании. После добавления 4мкл протеинкиназы К (20 mg/ml TE) была проведена инкубация при 65°С в39течение 15 минут. Затем добавили 70 мкл 10% SDS (натрий додецил сульфат) иинкубировали при 65°С в течение 45 минут. Лизированные клетки смешали содним объемом фенола и перемешивали в течение 4 минут. Затем провелицентрифугирование при 4000 об/мин в течение 15 минут.

Отобрали верхнююфракцию, к которой добавили 1 объем смеси фенол-хлороформ (1:1), иперемешивали в течение 4 минут. Смесь центрифугировали при 4000 об/мин втечение 15 минут. Отобрали верхнюю фракцию, к которой добавили 1 объемхлороформа, и перемешивали в течение 4 минут. Провели центрифугирование, азатем к верхней фракции, содержащей ДНК, добавили 2,5 объема 96% спирта,охлажденного до -20°С. Плавно перемешали и инкубировали при -20°С в течениеночи. Затем провели центрифугирование при 4000 об/мин в течение 15 минут.ДНК отмыли 70% спиртом и ресуспендировали в 100 мкл ТЕ буфера или воды.2.2.3 Выделение геномной ДНК набором ДНК-экспрессВыделение ДНК проводили набором «ДНК-экспресс» в соответствии срекомендациями производителя.2.2.4 Полимеразная цепная реакцияАмплификациюпроводиливаппаратах«Терцик»(сминерального масла) или C1000 при температуре отжига праймеров.Условия ПЦР при использовании аппарата С1000:1) 1 цикл – Денатурация 95°С 3 мин2) 35 цикловa) Денатурация 95°С 30 секb) Отжиг праймеров 55°С 30 секc) Элонгация 72°С 60 сек3) 1 цикл – Синтез 72°С 15 минСмесь на 25 мкл включала:добавлением401) Буфер 10х DreamTaq – 2,5 мкл2) Смесь dNTP (по 5mM каждого) – 1 мкл3) Праймер прямой 10 pmol/ml – 1 мкл4) Праймер обратный 10 pmol/ml – 1 мкл5) DreamTaq 5U/мкл – 0,125 мкл6) Вода дистиллированная – до 25 мкл7) ДНК – 0,5-5 мклРезультаты ПЦР оценивались в 1% агарозном геле с добавлением бромистогоэтидия.

Был использован 1х буфер ТАЕ (50х ТАЕ буфер: Трис , ЕДТА, ледянаяуксусная кислота). Визуализация результатов проводилась в трасниллюминатореVersaDoc.Таблица 1 – Праймеры, использованные для детекции генов СГВНазвание ПоследовательностьДНК Размерпраймера праймераГенпродукта,н.п.LP43cac cct caa cat ctc ctc ctcRP43tcc ctc gaa aaa cag ctc aatLP48aac tgc tgc tga tgg aac tgaRP48ggt cga aga gac gta cca accLP52tcc cat ctg gag gag ttc tgtRP52aga aat gag ctg cag aca ccaLP60tcc gtc tga atg gtt gtc ttgRP60cat tgt cga tcc tga aaa cga359Zeta токсина399Белка Zn-finger375Метилтрансферазы390VirB4компонентасистемысекрецииIV типаLP64gtc ctt tgg atc cac cac aatRP64ttg gct ttt gtc tca ggg ttt330VirD4компонентасистемы секрецииIV типаLP76tta acc gat caa gca cgt cagRP76gcc act atc acc acc agt tga378АТФ-зависимой Clpпротеазы41Продолжение таблицы 1Название ПоследовательностьРазмерпраймера праймерапродуктаГен, н.п.LP11aag caa gca gcg gtg att atRP11tct tcc agc gat tga aag gtLP14ttt tgg tgg ggt ttg atg atRP14tga tgt tcg aga gtg cga aa751ISSag4 транспозазыorfB806Сайт-специфическойрекомбиназысемействаизфаговыхинтегразLP16atc aag gca agc agt tga ggRP16tca aaa gac aaa cgc tcg aa500Белка, участвующеговрепликацииплазмидыLP24ggc ttg aag ctg tgt cat caRP24tgc ttg gtt gga att gtg aaLP25tta tca gca tgt ccc att cgRP25ttg gta ttg atc cgg tga ca696Рестриктазы типа IIGи метилтрансферазы988Сайт-специфическойрекомбиназысемействаизфаговыхинтегразLP27tcg gct gtt aaa acc acc tcRP27caa cgt ata aga gat ttg agg gaa g122Транскрипционногорегулятора,ассоциированногофагомLP35tga gca atc ttg gca atc agRP35ttg caa ttg gat gtg acc at421Галактозо-6-фосфатизомеразы,субъединица LacBLP38ttt tct gct ttg cga atc ctRP38ttt act cgc aag cac agt cg990Релаксазыс42Продолжение таблицы 1НазваниеПоследовательностьРазмерпраймерапраймерапродукта,Генн.п.cgt gat att acg ttt ggc aag asspB3485cca gtt cct gaa ccg ata aaa gадгезина SspB1ss_bam_Lcag ccg gat ccg gcc taa aaa 953Поверхностногоgga caa tgaадгезина SspB1ss_hind_R1536ПоверхностногоsspB1971tca cga agc ttc atc gga ttc acaata gstarfttc agc tgc gga tac tgt attstrarrtgc gtt gct ttc gta cta aga1339Lctg aaa ctc tga ttc atc agc470cgc ata agt cca ata cca atasspB1aFtgg taa tat tct ccc cct tggsspB1aRttg cca gat gaa gca gct att48aFgcc atg aga acc ctt cat gat t48aRctt tcg gat ttt tgc gga ta52aFccc act att gac ctt tcg tga52aRact cct ggg ttg gag ctt ttsspb1a1gcc aac att ctg tgg cat atc gsspb1a2tca cca gct gga acc aat gcc gsspb1a3ggc ata tcg cct tgg cca aag gsspb1a2tca cca gct gga acc aat gcc gПраймер 1 cgt gat att acg ttt ggc aag aПраймер 3 tca aac aaa ttt tgg gcc cgt ggc cta caa gcg gat aag609Поверхностногоадгезина SspB1889Поверхностногоадгезина SspB1220SspB1a447Гомолог белка Znfinger623Гомологметилтрансферазы461SspB1a448SspB1a или SspB1208Поверхностногоадгезина SspB143Продолжение таблицы 1НазваниеПоследовательностьРазмерГенпраймерапраймерапродукта,н.п.Праймер 2 cca gtt cct gaa ccg ata aaa g195Поверхностногоадгезина SspB1Праймер 4 att cta tga gtc gct gcc ga aatgaa cgg ttg gct ttt gtПраймер 5 ggg ccc aaa att tgt ttg a856эритромицинуПраймер 6 tcg gca gcg act cat aga at1314tct caa caa gtt cat gca gta ca1413aag ggt tgc gac att ctc acГен устойчивости к575Межгенноепространство геновgbs1313-gbs13142425ttg ctt gaa cag agc gat tc2524cga atg gga cat gct gat aa547Межгенноепространство геновgbs1324-gbs13257374cag gat ttt tgg cag gaa ac7473aac aat ggc att aaa cat tga aa477Межгенноепространство геновgbs1373-gbs13742.2.5 Мультиплексная полимеразная цепная реакцияДля идентификации типа СГВ по характеру полисахаридной капсулыприменяли мультиплексную ПЦР [90].ВотличиеотобычнойПЦРвместодвухпраймероввреакциииспользовались 10 праймеров для определения с Ia по IV серотипов и 8 праймеров– с V по VIII серотипов.

Принадлежность к серотипу оценивали по размеру ПЦРпродукта (таблица 2).44Таблица 2 – Праймеры для мультиплексной ПЦРНазваниеПоследовательность праймерапраймераIa-Fggt cag act gga tta atg gta tgcIa-Rgta gaa ata gcc tat ata cgt tga atg cIb-Ftaa acg aga atg gaa tat cac aaa ccIb-Rgaa tta act tca atc cct aaa caa tat cgII-Fgct tca gta agt att gta aga cga tagII-Rttc tct agg aaa tca aat aat tct ata gggIII-Ftcc gta cta caa cag act cat ccIII-Ragt aac cgt cca tac att cta taa gcIV-Fggt ggt aat cct aag agt gaa ctg tIV-Rcct ccc caa ttt cgt cca taa tgg tV-Fgag gcc aat cag ttg cac gta aV-Raac ctt ctc ctt cac act aat cctVI-Fgga ctt gag atg gca gaa ggt gaaVI-Rctg tcg gac tat cct gat gaa tct cVII-Fcct gga gag aac aat gtc cag atVII-Rgct ggt cgt gat ttc tac acaVIII-Fagg tca acc act ata tag cgaVIII-Rtct tca aat tcc gct gac ttРазмерСеротиппродукта, н.п.СГВ521 и 1876Ia770Ib397II1826III578IV701V487VI371VII282VIII2.2.6 Масс-спектрометрия штаммов стрептококков группы ВШтаммы СГВ выращивали на THB агаре в течение ночи.

На следующий деньклетки наносили на мишень. Клетки покрывали матрицей на основе α-циано-4гидроксикоричной кислоты. Масс-спектрометрия была проведена на прибореMaldi tof tof ultra flextreme в сотрудничестве с лабораторией биомедицинской ифармацевтической масс-спектрометрии отдела молекулярной микробиологииФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН под руководством Мильмана Б.Л. Анализ45проводился стандартным методом с параметрами: диапазон молекулярных весовсоставил от 2000 до 20000 Да, число лазерных импульсов – от 3000 до 10000, амощность лазера – 30-50%.2.2.7 Рестрикция ДНКДля проведения гидролиза ДНК рестриктазами смешивали 2 мкл буфера R, 2мкл буфера для BamHI, 0,5 мкл HindIII, 0,5 мкл BamHI, 10 мкл Н2О, 5 мкл ДНК.Инкубировали при 37°С в течение ночи.2.2.8 Лигирование ДНКДля сшивания фрагментов ДНК осуществлялась реакция лигирования сиспользованием ДНК лигазы фага Т4.

Во льду к 7 мкл амплификата добавили 1мкл вектора, 5 мкл буфера, 1 мкл Т4-лигазы, 36 мкл Н2О. Инкубировали прикомнатной температуре в течение двух часов, а затем в течение ночи при +4°С.2.2.9 Трансформация кишечной палочкиИзолированную колонию E. coli сеяли с агаризованной среды в LB бульон.Инкубировали при 37°С на шейкере в течение 16-18 часов. На следующий день1% ночной культуры посеяли и инкубировали при 37°С на шейкере до оптическойплотности 0,2-0,4 при длине волны 660 нм. Провели инкубацию культуры во льдув течение 5 минут. Клетки центрифугировали при 4°С. Осадок ресуспендировалив ½ от исходного объема холодного 50mМ СаСl2 и инкубировали во льду втечение часа. Клетки центрифугировали при 4°С. Осадок ресуспендировали в1/10 от исходного объема холодного 50mМ СаСl2. Компетентные клетки былиготовы. Затем в одной пробирке смешали 200 мкл компетентных клеток и 5 мклвектора (положительный контроль трансформации), а в другой – 200 мклкомпетентных клеток и 50 мкл лигазной смеси.