Диссертация (Структура острова патогенности XII стрептококков группы В), страница 10

Праймеры 1-3, 2-4 использовались дляполучения амплификатов, гомологичных гену sspB1 (расположение праймеровобозначено на рисунке 5). В результате полимеразной цепной реакции с ДНКштаммаO9ORбылиполученыамплификаты1-3,2-4.Праймеры5-6использовались для амплификации гена устойчивости к эритромицину. Всеамплификаты были вырезаны из геля и очищены. Так как праймеры 3 и 4являютсясоставными,тоамплификаты1-3и2-4содержалиобластигомологичные гену sspB1 и гену устойчивости к эритромицину (рисунок 14). Присмешивании амплификатов 1-3, 2-4 и 5-6 образовались комплементарные связи,что позволило амплифицировать слитую конструкцию, состоящую из трехамплификатов.

Для этого три амплификата в равных концентрациях использовалив качестве матрицы для полимеразной цепной реакции.671-32-45-6Амплификация с использованиемпраймеров 1-2–комплементарныепоследовательностигенуустойчивостикэритромицинуРисунок 14 – Конструкция слитого амплификатаВ результате ПЦР был получен фрагмент размером 1300 н.п., который былвырезан из геля и очищен. Таким образом, был получен слитый амплификат.Слитый амплификат был лигирован с вектором pGEMTEasy. Далее лигазнойсмесьютрансформироваликишечнуюпалочкуJM109.Клеткипослеклонирования высевали на чашки, содержащие эритромицин, Xgal, IPTG. ВекторpGEMTEasy содержит лактозный оперон.

При успешном лигировании вставки ивектора, лактозный оперон прерывается, а при лигировании самого вектора,лактозный оперон экспрессируется. При добавлении Xgal, IPTG к агару, клоны,содержащие только вектор, будут синего цвета, а клоны со вставкой – белого.Таким образом, легко идентифицировать колонии со вставкой. В результатеклонирования были получены 3 колонии: 1 синего цвета (1s), а 2 – белого (2s,3s).Из клонов были выделены плазмиды. Для подтверждения вставки слитогоамплификата в вектор была поставлена ПЦР с праймерами 1-2 с плазмидами.

Вкачестве положительного контроля использовалась ДНК штамма O9OR. Клонсинего цвета не дал положительного ответа с праймерами на вставку, а 2 клона68белого цвета дали положительный ответ, размер амплификата составил 1300 н.п(рисунок 15). Таким образом, слитый амплификат был клонирован в векторpGEMTEasy.1, 2, 3 – клоны 1s, 2s и 3s соответственно4 – O9ORРисунок 15 – Результаты клонирования слитого амплификатаДля дополнительного подтверждения клонирования слитой конструкции,было проведено секвенирование.Врезультатесеквенированиябылаполученапоследовательность,представленная на рисунке 16.TTATACTCCTAAAATCTTTACTCCTGAAAAACCAGTAACCTTTACTCCAAAATCAGTAGAAAAAGTGCCCCAACCTAGTTTGACCTTAACAAAAGTCACACTACCAACAAATCTGAAGCTAGAACCATTACCCAAAGCTCCACAAAAGCCAACCGTTCATTTCGGCAGCGACTCATAGAATTATTTCCTCCCGTTAAATAATAGATAACTATTAAAAATAGACAATACTTGCTCATAAGTAACGGTACTTAAATTGTTTACTTTGGCGTGTTTCATTGCTTGATGAAACTGATTTTTAGTAAACAGTTGACGATATTCTCGATTGACCCATTTTGAAACAAAGTACGTATATAGCTTCCAATATTTATCTGGAACATTTРисунок 16 – Последовательность слитой конструкции в плазмидеПри сравнении данной последовательности в компьютерной программеBLAST с геномной базой данных NCBI было определено, что частьпоследовательности гомологична гену sspB1 (обозначена курсивом), а втораячасть – гену устойчивости к эритромицину (обозначена подчеркиванием).

Такимобразом, слитый амплификат был успешно клонирован в вектор pGEMTEasy(плазмида 3s).69Таким образом, были созданы конструкции для экспрессии и инактивациигена sspB1.3.6 Сравнительный анализ белков SspB1 и SspB1a с гомологичными белкамидругих микроорганизмовСравнительныйиспользованиеманализбелковSspB1компьютерной(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2).ибылSspB1aпроведенпрограммыГомологиясоставиласClustalW272,7%,чтосогласуется с литературными данными [41]. Сравнительный анализ представленна рисунке 17.Рисунок 17 – Сравнительный анализ белков SspB1 и SspB1aПоиск гомологов белков SspB1 и SspB1a среди других микроорганизмов былосуществленсиспользованиемкомпьютернойпрограммыblastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Сравнительный анализ белков SspB1 и SspB1a сгомологами других микроорганизмов был произведен с помощью компьютерныхпрограмм ClustalW2, BLAST и MEGA6 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2,70http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Результаты представлены в таблице 12 и нарисунке 18. Белок SspB1a имеет высокую степень гомологии равную 94-97% сбелками микроорганизмов S. plurextorum, S. pasteurianus, S. orisratti, S. equinus, S.suis, S. thermophilus, S. porci, S. hyovaginalis, S. macedonicus, Staphylococcus aureus,Enterococcus faecium, S. equi subsp. zooepidemicus, относящихся как к патогенамчеловека и животных, так и к молочнокислым бактериям. Ряд белковмикроорганизмов S. intermedius, S. tigurinus, S. anginosus, S. constellatus обладалиболее низкой степенью гомологии с данным белком (77-79%).

Гомология белкаSspB1 с белками вышеперечисленных микроорганизмов, обладающими сходнойаминокислотной последовательностью, составила 72-75%. Таким образом,степень гомологии белка SspB1a с белками молочнокислых бактерий и патогеновчеловека и животных оказалась существенно выше по сравнению с белком SspB1.Филогенетический анализ показал, что гены, кодирующие белки SspB1 и SspB1a,принадлежали к геному общего предка.

В процессе эволюции произошладивергенция данных генов (рисунок 18).Рисунок 18 – Дендрограмма белков SspB1, SspB1a и их гомологов71Таблица 12 – Гомология белков SspB1 и SspB1a с белками другихмикроорганизмовВидSspB1SspB1aStreptococcus plurextorum73%97%Streptococcus intermedius73%77%Streptococcus pasteurianus73%95%Streptococcus orisratti73%95%Streptococcus equinus73%95%Streptococcus suis73%97%Streptococcus porci73%97%Streptococcus hyovaginalis73%96%Streptococcus macedonicus73%95%Streptococcus tigurinus74%78%Streptococcus thermophilus73%96%Streptococcus anginosus74%78%Streptococcus constellatus74%78%Staphylococcus aureus72%96%Enterococcus faecium72%96%Streptococcus equi subsp.

zooepidemicus72%94%3.7 Определение распространенности гена sspB1aРаспространенность гена sspB1a была определена среди 40 штаммов изРоссии, 12 штаммов из США, 56 штаммов из Португалии, 19 штаммов из Анголы,10 штаммов из Великобритании, 16 штаммов из Германии, 9 штаммов из Чешскойреспублики. Наличие гена sspB1a в геномах вышеупомянутых штаммовисследовали посредством ПЦР. Ген sspB1a был обнаружен у 17 штаммов из72России, у 3 штаммов из США, у 19 штаммов из Португалии, у 1 штамма изАнголы, у 2 штаммов из Великобритании, у 6 штаммов из Германии и у 2штаммов из Чешской республики (рисунок 19).

Распространенность гена sspB1aсреди штаммов СГВ составила 31% (50 штаммов из 162), что значительнопревышает распространенность гена sspB1.Рисунок 19 – Распространенность генов sspB1a и sspB1 среди штаммов СГВ3.8 Определение области интеграции острова патогенности,ассоциированного с геном sspB1На острове патогенности XII, по литературным данным, локализуется генscpB, кодирующий С5а-пептидазу [54].

Известно также, что данный генвстречается у 100% штаммов стрептококков группы В, выделенных от людей [30;37]. В тоже время в настоящей работе показано, что гены острова патогенности,локализованные вокруг гена sspB1, обнаруживаются только в геноме 14%штаммовизРоссии.Возникаетпротиворечиемеждуполученнымиилитературными данными.

По-видимому, ген scpB может быть локализован надругом генетическом элементе. Так, по данным ряда авторов, ген С5а-пептидазы73входит в состав сложного транспозона [47; 69]. Чтобы подтвердить локализациюданных генов на разных мобильных генетических элементах, были отобраны геныострова патогенности, локализованные между геном scpB и геном zeta токсина(данный ген достоверно обнаруживается только у штаммов с геном sspB1), сцелью определения 3’ конца острова, ассоциированного с геном sspB1.

Длярешения задачи посредством ПЦР были использованы праймеры на 8 геновданной области (таблица 1).Отобраны две группы штаммов стрептококков группы В: первая группавключала штаммы из России, в геноме которых были обнаружены гены островаот gbs1343 до gbs1364; а вторая – штаммы из России, Великобритании иПортугалии, в геноме которых данные гены отсутствовали. В первую группувошли 9, а во вторую – 68 штаммов (таблица 13).Ген gbs1311 присутствовал в геномах всех штаммов обеих групп, также какген scpB, то есть они принадлежали одному генетическому элементу.

Геныgbs1314, gbs1316 и gbs1324 были обнаружены в геноме некоторых штаммов обеихгрупп, а именно у 4 штаммов первой группы и у 34 штаммов второй группы.Данный участок присутствовал у следующих штаммов второй группы: у 24 – изРоссии, у 5 – из Великобритании и у 5 – из Португалии. Гены gbs1325, gbs1327,gbs1335, gbs1338 были обнаружены только в геноме 3 штаммов первой группы.Однако ген gbs1335, кодирующий галактозо-6-фосфат изомеразу оперона Lac.2,присутствовал в двух штаммах (161/05 и 369) из Португалии. Ген gbs1324присутствовал в геномах штаммов обеих групп, а ген gbs1325 только в геномахштаммов первой группы. Полученные данные позволили предположить, что 3’конец острова локализован между генами gbs1324 и gbs1325.

Так как геныgbs1314, gbs1316 и gbs1324 были обнаружены в геномах обеих групп, то они былилокализованы на одном генетическом элементе. При этом гены gbs1311 и scpBнаходится на другом элементе у всех исследованных штаммов СГВ (таблица 13).74Группа штаммовЧисло штаммовСтранаgbs1311gbs1314gbs1316gbs1324gbs1325gbs1327gbs1335gbs1338Таблица 13 – Результаты ПЦР со штаммами двух групп13Россия++++++++11Россия++++----15Россия+-------223Россия++++----21Россия++-+----222Россия+-------24Великобритания++++----21Великобритания+--+----25Великобритания+-------22Португалия++++--+-23Португалия++++----27Португалия+-------В межгенном пространстве генов gbs1324 и gbs1325 был осуществленпоиск прямых или инвертированных повторов в штамме NEM316 дляопределения 3’ конца острова, ассоциированного с геном sspB1.

В результатебыла обнаружена последовательность, которая образует вторичную структуру ввиде «шпильки»: aat aaa acc cca cca aga ttt aat ctt ggt ggg gtt ttg gt (рисунок 15).Данная структура также присутствовала в штаммах 09mas018883, GD201008-001,A909. В штамме 09mas018883 она локализована между гомологами генов gbs1324и gbs1325, а в штаммах GD201008-001 и A909 между гомологами генов gbs1324 иgbs1374. Ген gbs1374 кодирует рибосомный белок 50S L7/L12, который75расположен за островом патогенности XII. В связи с тем, что у двух штаммовпосле «шпильки» находится ген рибосомного белка, 3’ конец острова локализованмежду генами gbs1324 и gbs1325.

В штамме NEM316 между генами gbs1373 иgbs1374 была обнаружена другая последовательность с инвертированнымиповторами, также образующая вторичную структуру в виде «шпильки»: aaa caaaaa tcc tgc caa aga ttt ttt ggc agg att ttt ggc a (рисунок 20). Таким образом, 5’ конецострова находится между генами gbs1373 и gbs1374, что согласуется слитературными данными.АБРисунок 20 – Вторичные структуры ДНК в виде "шпилек", локализованные междугенами gbs1324-gbs1325 (А) и генами gbs1373-gbs1374 (Б)Остров патогенности XII, по литературным данным, имеет сходства иразличия в штаммах NEM316 и 2603V/R, т.е.