Автореферат (Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 4

8А). Увеличение количествафрагмента Sup45p, синтезируемого под контролем аллели sup45-104, говорит оповышении эффективности терминации трансляции при сверхэкспрессии SFP1.Об этом же свидетельствует снижение эффективности супрессии,зарегистрированное у этого мутанта при сверхэкспрессии SFP1. Вместе с тем,образующийся в результате преждевременной терминации трансляциифрагмент белка Sup45 не может обеспечить нормальную терминацию,поскольку у него отсутствуют 155 С-концевых аминокислотных остатков и,соответственно, сайт связывания со вторым фактором терминации – Sup35p(eRF3) (Eurwilaichitr et al., 1999).

Поскольку количество полноразмерного белкаSup45 в этом штамме не увеличивается, мы предположили, что повышениеэффективности терминации обусловлено повышением уровня Sup35p в этихштаммах. Проверка этого предположения показала, что при сверхэкспрессииSFP1 количество Sup35p во всех трех проанализированных штаммахдействительно увеличено (Рис. 8Б).АБРисунок 8. Уровень белков Sup45 (А) и Sup35 (Б) при сверхэкспрессии SFP1 в штаммах,несущих различные аллели гена SUP45. Знаком «*» отмечена зона неспецифическойгибридизации с антителами.Таким образом, сверхэкспрессия SFP1 не изменяет количество белкаSup45, а ее влияние на проявление нонсенс-мутаций sup45 обусловленоизменением количества белка Sup35.В то же время в случае штаммов, несущих миссенс-мутантные аллели15SUP45, повышенная продукция белка Sup35p не приводит к снижениюэффективности супрессии, то есть к увеличению эффективности терминациитрансляции.

Можно предположить, что мутантный белок Sup45 в этом случаехарактеризуется сниженным сродством к стоп-кодону, поэтому увеличениеколичества Sup35p не приводит к повышению эффективности терминации.4. Анализ продукции белков Sup35 и Sup45 в штамме, несущем делециюгена SFP1 или нормальную аллель этого генаПри исследовании роли гена SFP1 в поддержании детерминанта [ISP+]обнаружено, что помимо необратимой элиминации [ISP+], делеция SFP1 самапо себе приводит к слабой нонсенс-супрессии (Rogoza et al., 2008).

Кроме того,как показано в данной работе, количество белков Sup35 и Sup45 в штамме 2525-2B-П3982, несущем делецию SFP1, снижено (см. п. 1). Вероятно, этоявляется причиной повышения эффективности считывания стоп-кодонов, чтопроявляется на фенотипическом уровне как нонсенс-супрессия.Необходимо отметить, однако, что в упомянутых выше экспериментахиспользовался штамм, несущий нонсенс-супрессорную мутацию sup35-25.Поэтому наблюдаемые эффекты отражают модификацию фенотипическогопроявления мутантной аллели, нарушающей терминацию трансляции. Дляболее полной характеристики эффектов делеции гена SFP1, было интереснопосмотреть, как делеция SFP1 влияет на экспрессию генов SUP35 и SUP45 вотсутствие мутаций в этих генах.

С этой целью был использован штамм 1БД1606, несущий делецию гена SFP1 и нонсенс-мутации ade1-14 (UGA), his7-1(UAA), lys9-A21 (UAG) и trp1-289 (UAG). После этого сравнили фенотипыисходного штамма и штамма с делецией гена SFP1. Эффективность супрессииоценивали методом посева с разведениями. Мы обнаружили, что делеция SFP1приводит к нонсенс-супрессии по отношению ко всем четырем нонсенсмутациям (Рис. 9).Рисунок 9. Делеция гена SFP1 (здесь и далееобозначено как «sfp1∆») приводит к повышениюэффективности супрессии мутаций ade1-14, his7-1,lys9-A21 и trp1-289 по сравнению со штаммом,несущим нормальную аллель гена SFP1 (здесь идалее обозначено как «SFP1»).16Затем мы показали, что нонсенс-супрессорный эффект делеции гена SFP1связан со снижением уровня экспрессии генов SUP35 и SUP45. Это былопоказано как в отношении мРНК, транскрибируемой с этих генов (Рис.

10), таки в отношении белков Sup35 и Sup45 (Рис. 11). Следует отметить, что приоценке количества мРНК гена SUP45 из-за большого разброса значенийпорогового цикла в независимых биологических повторностях, подтвердить этиданные статистически не удалось. Тем не менее, во всех повторностяхзарегистрировано уменьшенное количество мРНК генов SUP35 и SUP45 вклетках с делецией SFP1 по сравнению с контролем.Рисунок 10. В штамме 1Б-Д1606, несущем делецию SFP1, количество мРНК генов SUP35(А) и SUP45 (Б) снижено по сравнению со штаммом, несущем нормальную аллель SFP1. Наоси ординат (ΔCq) отложена разница между значениями критического цикла дляисследуемого гена и референсного (ADH1) в логарифмическом масштабе, а каждая точкаобозначает одну биологическую повторность. Цифрами представлено соотношение медианвыборок.

* - различия статистически значимы (p < 0,05, критерий Вилкоксона-МаннаУитни).Рисунок 11. Делеция гена SFP1приводит к снижению количествабелков Sup35 и Sup45 по сравнениюсо штаммом, несущим нормальнуюаллель гена.ЗаключениеХарактеристикаэффектовсверхпродукциииприонизациитранскрипционного фактора Sfp1, а также делециии кодирующего его генаSFP1, позволила установить, что белок Sfp1 является позитивным регулятором17экспрессии гена SUP35. Увеличение количества белка Sup35 в штамме [ISP+] ив штаммах со сверхэкспрессией SFP1 объясняет природу антисупрессии,регистрируемой в этих штаммах. Роль белка Sfp1 в регуляции экспрессии генаSUP45 менее очевидна и, по всей видимости, опосредована белком Sup35.

Вкачестве иллюстрации, подводящей итоги исследования зависимостиэкспрессии генов SUP35 и SUP45 от уровня экспрессии гена SFP1 иприонизации белка Sfp1, можно предложить схему, представленную нарисунке 12.Рисунок 12. Уровень экспрессии генов SUP35и SUP45 зависит от статуса белка Sfp1.Чернымисплошнымисоединительнымилиниями показано негативное влияние наэкспрессию, а черными пунктирными линиямисо стрелкой — позитивное. Серая линияпоказывает, что достоверного влияния науровень экспрессии SUP45 зарегистрировано не было.Полученные в работе данные дополняют существующие представления огенетическом и эпигенетическом (прионном) контроле точности трансляции удрожжей.ВЫВОДЫ1.В штамме, содержащем прионную форму белка Sfp1, детерминант [ISP+],повышен уровень экспрессии гена SUP35 и снижен уровень экспрессии генаSUP45, что проявляется как на уровне мРНК этих генов, так и на уровнесоответствующих белков.2.Увеличение количества мутантного белка Sup35, синтезируемого подконтролем аллели SUP35, несущей миссенс-мутацию, может приводить кснижению эффективности нонсенс-супрессии, что свидетельствует окомпенсации нарушения терминации трансляции.3.Снижение эффективности нонсенс-супрессии в присутствии прионногодетерминанта [ISP+] обусловлено увеличением количества фактора терминациитрансляции Sup35р (eRF3).4.Экспрессия гена SFP1 с мультикопийной плазмиды снижаетэффективность нонсенс-супрессии, обусловленной мутациями sup35.

Вотношении мутаций sup45 это влияние носит аллеспецифичный характер.5.Снижение эффективности нонсенс-супрессии при повышении экспрессиигена SFP1 сопровождается увеличением количества белка Sup35 присохранении количества белка Sup45.6.Делеция гена SFP1 приводит к нонсенс-супрессии и сопровождаетсязначительным снижением уровня экспрессии генов SUP35 и SUP45 и,соответственно, уменьшением количества белков Sup35 и Sup45.7.Полученные данные позволяют утверждать, что ген SFP1 вовлечен вконтроль терминации трансляции путем регуляции синтеза факторатерминации Sup35 (eRF3).18СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ1. Drozdova P., Rogoza T., Radchenko E., Lipaeva P., Mironova L. Transcriptionalresponse to the [ISP+] prion of Saccharomyces cerevisiae differs from that induced bythe deletion of its structural gene, SFP1 // FEMS Yeast Research.

2014. doi:10.1111/1567-1364.12211.2. Дроздова П.Б., Радченко Э.А., Рогоза Т.М., Хохрина М.А., Миронова Л.Н.Ген SFP1 контролирует терминацию трансляции у дрожжей Saccharomycescerevisiae путем регуляции количества белка Sup35 (eRF3). // Молекулярнаябиология. 2013. Т. 47. №2. С. 275-281.3. Radchenko E., Rogoza T., Khokhrina M., Drozdova P., Mironova L. SUP35expression is enhanced in yeast containing [ISP+], a prion form of the transcriptionalregulator Sfp1 // Prion. 2011. V.

5 №4. P. 317-322.4. Иванов М.С., Радченко Э., Миронова Л.Н. Белковый комплекс Ppz1p/Hal3pи эффективность нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae //Молекулярная биология. 2010. Т. 44. №6. С. 1018-1026.5. Иванов М.С., Аксенова А.Ю., Бурдаева Я.В., Радченко Э.А., МироноваЛ.Н. Сверхэкспрессия гена PPZ1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae влияет наэффективность нонсенс-супрессии // Генетика. 2008. Т. 44. №2.

С. 177-184.Тезисы:1. Polina Drozdova, Tatiana Rogoza, Elina Radchenko, Polina Lipaeva, LudmilaMironova. How does [ISP+], the prion form of Sfp1p, control gene expression? //EMBO Conference «Gene transcription in yeast: From regulatory networks tomechanisms» (Sant Feliu de Guixols, Spain). 2014. P. 81.2. Дроздова П.Б., Липаева П.В., Рогоза Т.М., Радченко Э.А., Миронова Л.Н.Прионизация белка Sfp1 регулирует экспрессию гена SUP45 у дрожжей // VIсъезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) (Ростов-наДону). 2014. С. 56.3.

Radchenko E.A., Drozdova P.B., Rogoza T.M., Mironova L.N. Identification ofprion domain in Sfp1 protein in Saccharomyces cerevisiae // 26th InternationalConference on Yeast Genetics and Molecular Biology (Frankfurt/Main, Germany).2013. V. 30. P. S117.4. P. Drozdova, E. Radchenko, T. Rogoza, P. Lipaeva, L. Mironova.

Sfp1 prionconversion is not equal to the absence of this yeast protein // 38th FEBS Congress(Saint-Petersburg, Russia). 2013. P. 76.5. Polina Drozdova, Elina Radchenko, Tatyana Rogoza, Polina Lipaeva, LudmilaMironova. Prion switch of the Sfp1 protein dramatically changes transcription profilein yeast // Сonference «Protein misfolding in disease: molecular processes andtranslational research toward therapy» (Roscoff, France). 2013. P.

48.6. Радченко Э.А., Дроздова П.Б., Рогоза Т.М., Хохрина М.А., Миронова Л.Н.Идентификация прионного домена в белке Sfp1 у дрожжей Saccharomycescerevisiae // V международная школа молодых ученых по молекулярнойгенетике«Непостоянствогенома»(Звенигород).2012.С.3.7. Дроздова П.Б., Радченко Э.А., Рогоза Т.М., Хохрина М.А., Миронова Л.Н.Прионизация белка Sfp1 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae зависит отгенотипического фона штамма // 16-ая Международная Пущинская школаконференция молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино).

2012.P. 102-103.8. Radchenko E., Rogoza T., Drozdova P., Khokhrina M., Mironova L.Antisuppression caused by [ISP+] prion is determined by the increased amount ofSup35p (eRF3) // 25th International Conference on Yeast Genetics and MolecularBiology (Olsztyn, Poland). 2011.

P. S133.9. Drozdova P., Radchenko E., Khokhrina M., Rogoza T., Mironova L. Effects ofSFP1 overexpression in Saccharomyces cerevisiae strains containing sup35 andsup45 nonsense suppressor mutations // Conference «Non-Conventional Yeast in thePostgenomic Era» (Lviv, Ukraine). 2011. P. 12.10. Ivanov M.S., Radchenko E.A., Mironova L.N.

Phosphatase Ppz1p influencesthe efficiency of nonsense suppression by pathways distinct from thedephosphorylation of the elongation factor EF1Bα in yeast Saccharomyces cerevisiae// 12th International Congress on Yeast (Kyiv, Ukraine). 2008. P. 145..