Автореферат (Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 3

Этот штамм мы трансформировали плазмидами серииpRSU1, несущими мутантные аллели SUP35: sup35-10, sup35-25, sup35-228 иsup35-240 (см. табл. 2) После этого проводили элиминацию плазмидыpYCHU2, пассируя клетки на полной среде YEPD. Полученные штаммы,несущие мутации sup35 на плазмиде pRSU1, трансформировалимультикопийными плазмидами pRS426-SFP1 и pRS426 (в качестве контроля).Далее трансформантов оценивали по эффективности супрессии. Мыобнаружили, что у всех трансформантов происходит снижение эффективностинонсенс-супрессии при сверхэкспрессии SFP1 (Рис. 3).

Правда, всеисследованные штаммы в той или иной степени демонстрировали снижениескорости роста при сверхэкспрессии SFP1, поэтому в некоторых комбинацияхнонсенс-мутаций и мутаций sup35 ослабление роста было обусловлено, повидимому, обеими причинами. Тем не менее, в некоторых комбинациях10супрессорной и супрессируемой мутаций, как, например, sup35-240 и ade1-14,снижение эффективности нонсенс-супрессии было очевидно и само по себе.Таким образом, сверхэкспрессия SFP1 приводит к снижению эффективностисупрессии, вызванной различными по своей природе (нонсенс- и миссенс-)мутациями sup35.Рисунок 3. Наличие мультикопийной плазмиды pRS426-SFP1 приводит к снижениюэффективности супрессии мутаций ade1-14, his7-1, lys2-90 в штаммах, несущих различныеаллели SUP35. Штамм, несущий плазмиду с геном SUP35 дикого типа, обозначен как «д.т.»;штаммы, несущие плазмиды с мутантными аллелями sup35-10, sup35-25, sup35-228, sup35240, обозначены цифрами 10, 25, 228 и 240, соответственно. Здесь и далее представлены пятьпоследовательных пятикратных разведений (концентрация клеток уменьшается слеванаправо).

Знаком «Ø» здесь и далее обозначена контрольная плазмида pRS426; плазмидаpRS426-SFP1 обозначена как «↑SFP1».Для того чтобы выяснить, обусловлено изменение фенотипатрансформантов увеличением копийности гена SFP1, или оно являетсяследствием возникновения в таких клетках прионной формы Sfp1p, мыэлиминировали плазмиду pRS426-SFP1, пассируя клетки на полной средеYEPD. Дальнейший анализ клонов, потерявших плазмиду с геном SFP1,показал, что супрессорный фенотип восстановился у всех отобранных клонов,несущих мутации sup35-240, sup35-25, sup35-228 (в каждом случае былопроанализировано не менее 60 клонов). Следовательно, сверхэкспрессия генаSFP1 в этих штаммах приводит к снижению эффективности нонсенс-супрессии,не связанному с возникновением прионного детерминанта [ISP+].Вместе с тем, в случае штамма, несущего мутацию sup35-10, 4 клона из100 проанализированных сохранили несупрессорный фенотип после потериплазмиды.

На рисунке 4 представлено по одному клону обоих типов(восстановивших фенотип Sup+ и сохранивших фенотип Sup- после элиминацииплазмиды).11Рисунок 4. Фенотип Sup- сохраняется у некоторых клонов, несущих мутацию sup35-10,после потери плазмиды с геном SFP1. Здесь и далее элиминация плазмид, которыесодержались в клетках исследованных штаммов, отражена путем перечеркивания ихназваний. (1) — клон, утративший плазмиду pRS426 (контроль), (2) – клон, утратившийплазмиду pRS426-SFP1 и восстановивший фенотип Sup+, (3) – клон, утративший плазмидуpRS426 и сохранивший фенотип Sup-..Одной из функций гена SFP1 является контроль размера клеток.Показано, что размер клеток штамма, несущего делецию гена SFP1, на 40%меньше, чем размер клеток штамма, несущего нормальную аллель SFP1(Jorgensen et al., 2002).

В работах нашей группы показано, что клетки штамма[ISP+] несколько превышают по размеру клетки штамма [isp-] (Rogoza et al.,2010). В связи с этим, мы решили проверить, отличаются ли по размеру клетокклоны, предположительно содержащие [ISP+], от клонов, прошедших черезпроцедуру пассирования на среде с универсальным антиприонным агентом –хлоридом гуанидина (GuHCl). Мы обнаружили, что размер клеток до и послепассирования на среде с GuHCl статистически значимо различается (Рис.

5).*********Рисунок 5. Средняя площадь клетокисходного штамма, несущего sup35-10 (1),клона, сохранившего фенотип Sup- послеэлиминации плазмиды pRS426-SFP1 (2) ивосстановившего фенотип Sup+ послепассирования на среде с GuHCl (3).Приведены ошибки средних. *** - p<0.001.Эти данные также подтверждают вывод о том, что в штамме, несущеммутацию sup35-10, временное повышение экспрессии гена SFP1 привело квозникновению наследственного детерминанта, схожего по своему проявлениюс прионом [ISP+]. Анализ последовательности гена SUP45 из двух клонов,сохранивших фенотип Sup- после потери мультикопийной плазмиды, показалотсутствие отличий от опубликованной последовательности гена SUP45 дикоготипа штаммов Петергофских генетических линий (Mironova et al., 1995). Этоозначает, что возникновение [ISP+] возможно и в отсутствие криптическихмутаций в гене SUP45, однако эффективность образования приона в этомслучае, по-видимому, ниже, чем в случае комбинации мутаций sup35-25 иsup45-400, либо sup35-10 и sup45-75.12Таким образом, проявление мутаций sup35 модифицируется присверхэкспрессии SFP1, причем эта модификация может быть обусловлена какприонизацией белка Sfp1, так и сверхпродукцией его нормальной изоформы.

Вобоих случаях эта модификация проявляется на фенотипическом уровне какснижение эффективности нонсенс-супрессии.Ранее мы показали, что в присутствии детерминанта [ISP+] уровеньтранскрипции гена SUP35 и продукции белка Sup35 выше, чем в штамме [isp-].Сходство фенотипических эффектов [ISP+] и повышенной продукции белкаSfp1 позволяет предположить, что в штаммах [isp-], сверхпродуцирующихSfp1р, экспрессия гена SUP35 также повышена. Для проверки этогопредположения мы трансформировали штамм 21-Д863, несущий аллель генаSUP35 дикого типа, мультикопийными плазмидами pRS426-SFP1 и pRS426 дляконтроля. Оценка количества мРНК гена SUP35, проведенная с помощью ПЦРв режиме реального времени, показала, что ее количество в клетках,сверхэкспрессирующих SFP1, увеличено по сравнению c контролем. Этотрезультат воспроизводился в каждой из трех повторностей, однако из-забольшого разброса значений порогового цикла в случае различныхбиологических повторностей, подтвердить эти данные статистически неудалось.

Очевидно, в этом случае требуется большее, чем обычно, количествоповторностей. Тем не менее, вывод об усиленной экспрессии гена SUP35 вклетках штамма [ISP+] был подтвержден в эксперименте по оценке количествабелка Sup35 с помощью вестерн-блот-гибридизации (Рис. 6). Таким образом,сверхэкспрессия гена SFP1 повышает количество белка Sup35, а нафенотипическом уровне снижает эффективность супрессии, обусловленноймутациями sup35.Рисунок 6.

Количество Sup35p увеличено при сверхэкспрессии SFP1 вштамме 21-Д863, несущем аллель SUP35 дикого типа. Использоваласьмультикопийная плазмида pRS426-SFP1 (↑SFP1) и pRS426(Ø)(контроль). Цифрами представлено отношение интегральнойоптической плотности полос, характеризующей штамм сосверхэкспрессией SFP1, к тому же показателю в контроле.После этого мы проанализировали влияние сверхэкспрессии SFP1 напроявление мутаций в гене SUP45.

Для этого был использован штамм 1АД1628, несущий нонсенс-мутации аde1-14 и trp1-289. В этом штамме мыпровели замену плазмиды pRS316, несущей аллель дикого типа гена SUP45, насерию плазмид pRS315, несущих мутантные аллели sup45. Среди этих аллелейбыло пять аллелей с нонсенс-мутациями (sup45-101, -102, -104, -105, -107) и двеаллели с миссенс-мутациями (sup45-103 и -116) (см. табл. 2). Последующий13анализ фенотипа отобранных клонов показал, что все мутации sup45,проклонированные в составе плазмиды pRS315, проявляют супрессорныйэффект по отношению к нонсенс-мутациям аde1-14 и trp1-289.Полученные штаммы трансформировали плазмидами pRS426-SFP1 иpRS426.

Мы обнаружили, что повышенная экспрессия гена SFP1 по-разномувлияет на проявление мутаций sup45. В случае штаммов, несущих нонсенсмутации sup45, отмечалось ослабление эффективности нонсенс-супрессиипрактически во всех комбинациях мутаций sup45 и супрессируемых мутаций. Вслучае штаммов, несущих миссенс-мутации sup45, наблюдался разный эффектпо отношению к мутациям ade1-14 и trp1-289 (Рис. 7).Следует отметить, что штаммы, несущие плазмиду pRS426-SFP1,практически во всех случаях демонстрировали более слабый рост на полнойсреде по сравнению с контролем. Таким образом, как и в случае мутантовsup35, регистрируемый на селективных средах фенотип является отражениемдвух эффектов: снижения жизнеспособности и изменения эффективностинонсенс-супрессии.Рисунок7.СверхэкспрессияSFP1приводит к разным фенотипическимэффектам на фоне различных аллелейSUP45.Представленырезультатыфенотипическогоанализаштаммов,несущих: (А) SUP45 дикого типа; (Б)нонсенс-мутантные аллели sup45; (В)миссенс-мутантные аллели sup45.После потери плазмиды, несущей SFP1, у всех клонов восстанавливалсяпервоначальный супрессорный фенотип.

Таким образом, наблюдаемая притрансформации мультикопийной плазмидой pRS426-SFP1 антисупрессияобусловлена повышением количества белка Sfp1 и не связана с возникновениемприона [ISP+].14На следующем этапе мы оценили влияние повышенной экспрессии генаSFP1 на уровень белка Sup45 в производных штамма 1А-Д1628, несущихаллель SUP45 дикого типа, а также мутантные аллели sup45-104 (несет стопкодон UAA) и sup45-116 (несет миссенс-мутацию). Вестерн-блот анализпоказал, что сверхэкспрессия SFP1 не влияет на количество белка Sup45 вштаммах, несущих аллель дикого типа SUP45 и миссенс-мутацию sup45-116. Вштамме с нонсенс-мутацией sup45-104 сверхэкспрессия SFP1 приводит кувеличению количества фрагмента белка Sup45, образующегося притерминации трансляции на стоп-кодоне, возникшем вследствие мутации.Количество полноразмерного Sup45p в этом штамме такое же, как в контроле,при нормальном уровне экспрессии SFP1 (Рис.