Автореферат (Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 2

Жака Моно «Protein misfolding in disease:molecular processes and translational research toward therapy» (Роскоф, Франция,2013 г.), на конференции EMBO «Gene transcription in yeast: From regulatorynetworks to mechanisms» (Жирона, Испания, 2014 г.), на VI съезде ВОГиС(Ростов-на-Дону, Россия, 2014 г.).Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы,материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы (284источника).

Работа содержит 6 таблиц и 31 рисунок.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫШтаммы. Генотипы штаммов дрожжей Saccharomyces сerevisiae,использованных в работе, приведены в таблице 1.Таблица 1. Штаммы Saccharomyces cerevisiae, использованные в работе.Название штамма ГенотипПроисхождение1А-Д1628MATα ade1-14 his3 lys2 ura3-52 trp1-289 leu2- Moskalenko et al., 20033,112 SUP45::HIS3 [pRS316-SUP45]21-Д863MATα ade1-14 his7-1 lys2-90 ura3-52 trp1-289 Задорский и др., 2003leu2-3,112 SUP35::TRP1 [pYCHU2]1Б-Д1606МАТα ade1-14 his7-1 lys9-A21 trp1-289 ura3-52 Moskalenko et al., 2003leu2-3,112sfp1Δ-1Б-Д1606МАТα ade1-14 his7-1 lys9-A21 trp1-289 ura3-52 А.Б.

Даниловаleu2-3,112 sfp1Δопубликовано)(неМАТα ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3Δ leu2-1 thr4- Volkov et al., 200225-25-2В-П3982* B15 sup35-25 sup45-400 [ISP+] и [isp-]sfp1Δ-25–25-2ВП3982**МАТa ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3Δ leu2-1 thr4- Rogoza et al., 2010B15 sup35-25 sup45-400 sfp1Δ [isp-]Плазмиды. В работе использовали центромерные плазмиды серии pRSU1(Volkov et al., 2002) и pRS315 (Sikorski and Hieter, 1989), различающиесяаллелями гена SUP35 (Chabelskaya et al., 2004, Volkov et al., 2002) и SUP45 (LeGoff et al., 2002; Moskalenko et al., 2003; Москаленко и др., 2004)соответственно (Табл. 2). Плазмида pRS426-SFP1 получена С. А. Родионовой,плазмида pRSU3-25 – К.В. Волковым (Volkov et al., 2002).

В работе также6использованы плазмиды pRS425 и pRS426 (Christianson et al., 1992).Таблица 2. Характеристика плазмид серий pRSU1 и pRS315.ПлазмидаАллель генаНуклеотидная заменаpRSU1pRSU1-10pRSU1-25pRSU1-228pRSU1-240pRS315-SUP45pRS315-101pRS315-102pRS315-103pRS315-104pRS315-105pRS315-107pRS315-116SUP35sup35-10sup35-25sup35-228sup35-240SUP45sup45-101sup45-102sup45-103sup45-104sup45-105sup45-107sup45-116G1087AC1133TG1115AC166TG796TT159AT62CT848АG1153TT950GG185CАминокислотная замена,мутации363Asp → Asn (миссенс)378Thr → Ile (миссенс)372Arg→Lys (миссенс)56Gln→UAA (стоп)266Glu→UAA (стоп)53Tyr→UAA (стоп)21Leu→Ser (миссенс)283Leu→UAA (стоп)385Glu→UAA (стоп)317Leu→ UGA (стоп)62Arg→Thr (миссенс)типМетоды.

В работе использовали стандартные методы и культуральные среды,применяемые при работе с дрожжами и бактериями (Захаров и др., 1984;Sherman et al., 1986; Sambrook et al., 1989; Kaiser et al., 1994), а такжестандартные молекулярные и биохимические методы (Sambrook et al., 1989;Inoue et al., 1990, Gietz et al., 1992, Kaiser et al., 1994, Gietz and Woods, 2006).Для элиминации плазмид, несущих маркерный ген URA3, использовали средуSC, содержащую 5-фтороротовую кислоту (FOA, Angus) в концентрации1мг/мл (Kaiser et al., 1994).

Для детекции ауксотрофности по аденинуприменяли среду ¼ YEPD (Eaglestone et al., 2000). Для сравненияэффективности нонсенс-супрессии применяли упорядоченный посев штаммовдрожжей на селективные среды с использованием серий последовательныхразведений суспензии клеток.Для выделения РНК использовали PureZol (Bio-Rad), для реакцииобратной транскрипции – набор RevertAid Reverse Transcriptase(ThermoScientific), для ПЦР в режиме реального времени – набор реагентовEVA Green (Синтол) и ПЦР-амплификатор СFX96 (Bio-Rad). Для каждогоэксперимента выделяли не менее трех независимых проб тотальной мРНК.Нормализованное соотношение экспрессии анализируемого гена (SUP35 илиSUP45) к экспрессии контрольного гена (ADH1 или ACT1) оценивали пометоду Ливак (Livak and Schmittgen, 2001).Выделение и электрофорез белков осуществляли по методике (Kushnirovet al., 2006) с модификациями.

Для иммунодетекции белков Sup35 и Sup45использовали набор реагентов ECL Plus Western Blotting Detection System(Amersham, Швеция) и первичные поликлональные антитела SE90 и SE45-2.Антитела SE90 предоставлены С.В. Шабельской, SE45-2 – С.Е. Москаленко.Полученные с помощью прибора GeneGnome (Syngene) изображениясканировалииобрабатываливпрограммеImageJ1.44p7(http://rsbweb.nih.gov/ij/). Выравненность концентраций белков оценивали спомощью окрашивания мембраны в растворе Кумасси R-250 согласнопротоколу (Welinder and Ekblad, 2011).Секвенирование осуществляли в фирме "АТГ Сервис-ген", в компании«Бигль» и на базе ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных иклеточных технологий».Cтатистическую обработку результатов производили с помощьюпрограмм RConsole (R Development Core Team, 2012; www.r-project.org) иOpenOffice.org Calc.

Для попарных сравнений применяли критерийВилкоксона-Манна-Уитни (Sokal and Rohlf, 1995; Шипунов и др., 2012).РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ1. Влияние детерминанта [ISP+] на экспрессию генов SUP35 и SUP45Прионная форма белка Sfp1, детерминант [ISP+], снижает эффективностьсчитывания стоп-кодонов как значащих в штаммах, несущих нонсенссупрессорные мутации sup35-10 и sup35-25 и криптические мутации sup45-400и sup45-75 (Volkov et al., 2002, Аксенова и др., 2006). Однако прямые данные,связывающие изменение эффективности нонсенс-супрессии с функцией белкаSfp1p в его нормальной и прионной форме, отсутствовали.

Вместе с темлогично предположить, что антисупрессия, то есть усиление эффективноститерминации трансляции, может быть связана с увеличением количества белков,обеспечивающих этот процесс. В связи с этим мы сравнили характерэкспрессии генов SUP35 и SUP45 в [ISP+] и [isp-] вариантах штамма 25-25-2ВП3982, а также в производном этого штамма, несущем делецию гена SFP1 (вдальнейшем они обозначаются как [ISP+], [isp-] и sfp1Δ-штаммы).На первом этапе мы сравнили количество мРНК этих генов висследуемых штаммах с помощью ПЦР в режиме реального времени иобнаружили, что эффективность транскрипции гена SUP35 в штамме [ISP+]примерно в 4 раза выше, чем в штамме [isp-]. Однако уровень экспрессии генаSUP45 изменяется в противоположную сторону: в штамме [ISP+] количествомРНК SUP45 снижено в 1,25 раза.

Наименьший уровень экспрессии обоихгенов наблюдали в штамме sfp1Δ. Таким образом, транскрипция по крайнеймере одного из двух генов, кодирующих факторы терминации трансляции, генаSUP35, в штамме [ISP+] усилена по сравнению с двумя другими штаммами,использованными в этом эксперименте.Известно, что изменения в уровне транскрипции генов не всегда прямокоррелируют с изменениями в количестве соответствующих белков. Поэтомуна следующем этапе работы мы оценили количество белков Sup35 и Sup45 вэтих же штаммах с помощью вестерн-блот анализа и показали, что различия вколичестве белков Sup35 и Sup45 между штаммами [ISP+], [isp-] и sfp1Δкоррелируют с различиями в уровне мРНК (Рис. 1А, 1Б).АБ8Рисунок 1.

Количествобелков Sup35 (А) и Sup45(Б)различаетсявштаммах [ISP+], [isp-] иsfp1Δ.Цифрамипредставлено отношениеинтегральной оптическойплотностиполоснапленке, характеризующейштаммы [ISP+] и sfp1Δ, кконтролю, штамму [isp-].Таким образом, можно предположить, что изменение фенотипа штамма ссупрессорного (Sup+) на несупрессорный (Sup-), наблюдаемое привозникновении [ISP+], связано с увеличением количества белка Sup35 (eRF3).2.

Сверхэкспрессия мутантной аллели гена SUP35 приводит кантисупрессииПонятно, что увеличение количества фактора терминации трансляцииможет повысить эффективность этого процесса. Вместе с тем, необходимоподчеркнуть, что функция белка Sup35 в использованных штаммах частичнонарушена, поскольку он синтезируется под контролем мутантной аллели sup3525. Ранее показано, что эта мутация снижает эффективность считывания стопкодонов всех трех типов (Volkov et al., 2002). Чтобы проверить, может лиувеличение количества мутантного белка Sup35 компенсировать дефектнарушения терминации трансляции, мы трансформировали штамм 25-25-2ВП3982 [isp-] мультикопийной плазмидой pRSU3-25, несущей аллель sup35-25.Фенотипический анализ трансформантов показал, что экспрессия аллелиsup35-25 с мультикопийной плазмиды приводит к изменению фенотипа штаммас Sup+ на Sup- (Рис. 2А).

Вестерн-гибридизация с использованием антител SE90,опознающих Sup35p, показал, что количество Sup35p у этих трансформантовдействительно увеличено (Рис. 2Б).Рисунок 2. Экспрессия мутантной аллели sup35-25 с мультикопийной плазмиды pRSU3-25приводит к антисупрессии (А) и к значительному увеличению количества белка Sup35 (Б).Плазмида pRS425 использована в качестве контроля.9Таким образом, хотя замена Thr378→Ile в белке Sup35 приводит кснижению эффективности терминации, увеличение количества мутантногобелка Sup35 компенсирует это снижение.

Следовательно, антисупрессия,наблюдаемая при возникновении [ISP+], также может быть следствиемувеличения количества белка, синтезируемого под контролем аллели sup35-25.3. Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на проявление мутаций sup35и sup45В соответствии с критериями прионного наследования, сверхэкспрессиягена SFP1, являющегося структурным геном приона [ISP+], в штаммах [isp-]приводит к индукции этого приона. Однако ранее в работах нашей группыпоказано, что антисупрессорный эффект, связанный со сверхэкспрессией SFP1,не всегда обусловлен возникновением [ISP+], поскольку примерно у четвертитрансформантов элиминация плазмиды, несущей SFP1, приводит квосстановлению исходного супрессорного фенотипа (Rogoza et al., 2008).Снижение эффективности нонсенс-супрессии в результате повышенияпродукции белка Sfp1 может рассматриваться как указание на прямое иликосвенное участие этого белка в регуляции терминации трансляции.

Штамм, накотором было показано, что сверхэкспрессия SFP1 приводит к возникновениюприона [ISP+], содержит нонсенс-супрессорную мутацию sup35-25 икриптическую мутацию sup45-400. Ранее прион [ISP+] был обнаружен также вштамме, несущем нонсенс-супрессорную мутацию sup35-10 и криптическуюмутацию sup45-75 (Volkov et al., 2002; Аксенова и др., 2006). Для расширенияпредставления о влиянии гена SFP1 на терминацию трансляции необходимопроанализировать эффекты сверхэкспрессии гена SFP1 в штаммах, несущихдругие комбинации аллелей SUP35 и SUP45.Для этого мы использовали штамм 21-Д863, содержащий дизрупциюхромосомной копии гена SUP35 и компенсирующую эффект дизрупциицентромерную плазмиду pYCHU2, несущую аллель SUP35 дикого типа.Отличие этого штамма от использованных ранее заключается также в том, чтоон несет аллель дикого типа гена SUP45, что было специально подтвержденосеквенированием.