Диссертация (Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на ранее эмбриональное развитие человека), страница 3

Поэтомуцикл – это время созревания очередной генерации сперматогенных клеток.Между клетками Сертоли существуют плотные контакты, которые создают особыйгематотестикулярный барьер. Он изолирует клетки сперматогенного ряда от контакта склетками иммунной системы и поддерживает специфическую среду для прохождения всехэтапов сперматогенеза. Кроме того, клетки Сертоли фагоцитируют сперматогенные клетки,которые погибают в процессе сперматогенеза, а также цитоплазматические капельки,отшнуровывающиеся от поздних сперматид. Также клетки Сертоли секретируют в просветканальца жидкость, в которой окажутся сперматозоиды после потери связи сосперматогенным эпителием. На поверхности клеток Сертоли расположены рецепторыфолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона и тестостерона.

Клетки    10  Сертоли координируют процесс развития сперматогенных клеток и их перемещение кпросвету канальца, а также контролируют прохождение волны инициации сперматогенезавдоль семенного канальца (Zini and Agarwal et al., 2011).Сперматогониисоставляютвсего0,03%отобщегоколичестваклетоксперматогенного ряда сперматогенного эпителия (Meistrich and Van Beek, 1993). Пулсперматогониев разделяют на три функционально различных типа в зависимости отморфологических характеристик их ядра: тип Ad (dark – «темный»), тип Ap (pale «светлый»)и тип В (Clermont, 1966).

Сперматогонии типа Ad способны к митотическому делению собразованием как двух идентичных Ad сперматогониев, так и двух идентичных Apсперматогониев. Сперматогонии типа Ad непосредственного участия в образованиисперматозоидов не принимают. Их основной функцией является поддержание численностипопуляции сперматогониев. Сперматогонии типа Ap повторно делятся митотически, приэтом между клонами остаются контакты, так называемые цитоплазматические мостики, иформируетсяплазмодиум,обеспечивающийсинхронизациюпоследующихсобытийпроисходящих с клетками. После завершения деления эти клетки дифференцируются всперматогонии типа В. Они в свою очередь также делятся митозом с образованием двухидентичных клеток, называемых сперматоцитами первого порядка, или сперматоцитами I.Сразу после рождения собственно эпителиальными клетками сперматогенногоэпителия – клетками Сертоли - начинают синтезироваться особые факторы, обеспечивающиеподдержание сперматогоний в недифференцированном состоянии.

Так, ключевыми в данномпроцессе являются белки GDNF (glialcellline-derived neurotrophic factor) и фактор ростафибробластов (bFGF, basic fibroblast growth factor) (Hofmann et al., 2005). Следует отметить,что мутация в гене фактора GDNF и его рецептора у самцов мыши летальна (Sanchez et al.,1996). Дифференцировка сперматогоний определяется активацией транскрипции генаклеточного рецептора c-kit (Dolci et al., 2001). Связывание лиганда, продуцируемогоклетками Сертоли, с рецептором с-kit обеспечивает запуск транскрипции многих генов, втом числе тех, продукты которых обеспечивают вступление клетки в мейоз (Rossi et al.,2008).В процессе сперматогенеза выделяют несколько последовательных этапов:•сперматоцитогенез;•спрематидогенез;•спермиогенез.В ходе первого этапа сперматогенеза – сперматоцитогенеза - происходитмитотическое деление сперматогоний с образованием сперматоцитов I порядка, которые    11  затем вступают в первое деление мейоза, завершающееся образованием сперматоцитов IIпорядка.Важнымэтапом,предшествующимлюбомуклеточномуделению,являетсявозникновение тесной связи (когезии) между сестринскими хроматидами.

Когезиянеобходима для удержания сестринских хроматид во время метафазы, а также дляправильной ориентации и расхождения хромосом (Valdeolmillos et al., 2007). Когезиясестринских хроматид происходит с участием мультипротеиновых комплексов – когезинов(Гришаева с соавт., 2010). В установлении когезии участвуют белки семейства SMC(structuralmaintenanceofchromosome)(SMC3,SMC1α,SMC1β)иSCC(sisterchromatidecohesion) (SCC1, SCC3) (Costa and Cooke, 2007). В профазе мейоза I белкикогезии служат опорой для белков рекомбинации и белков синаптонемного комплекса(Hagstrom and Meyer, 2003).На стадии зиготены профазы первого деления мейоза начинается конъюгация сначалана отдельных участках хромосом, а потом и по всей их длине, что приводит к образованиюбивалента.

Кроме двух сконъюгированных хромосом в состав бивалента входит структурасинаптонемного комплекса, состоящая из трех белковых единиц: двух латеральныхэлементов, соединенных трансверсальными филаментами, и одного центрального. В составлатеральныхэлементовсинаптонемногокомплексавходятбелкиSCP2иSCP3,трансверсальных филаментов – белок SCP1, центрального филамента – SYCE1 и SYCE2(Hermo et al., 2010). У человека в отсутствии данных белковых продуктов нарушаетсяформирование синаптонемного комплекса и синапсис хромосом, наблюдается блокированиесперматогенеза на стадии зиготены (Costa et al., 2005; Hamer et al., 2006; Bolcun-Filas et al.,2007).

Важную роль в формировании синаптонемного комлекса также играет РНКсвязывающий белок CPEB (Cytoplasmic polyadenylation element binding protein). У мышейCpeb-/- наблюдается блокирование сперматогенеза на стадии пахитены (Tay and Richter,2001).В диплотене начинается отталкивание гомологов, становятся различимы хиазмы,свидетельствующие об обмене гомологичными участками хромосом.

В местах прохождениякроссинговера локализуется белок DMC1, который также отвечает за расхождение хромосомв первом делении мейоза (Hermo et al., 2010). Вместе с белком DMC1 на каркасесинаптонемного комплекса локализован белок RAD51, участвующий в активации обменовмежду участками хромосом. Мыши с делецией гена данного белкового продукта гибнут наранних этапах эмбрионального развития (Deans et al., 2000). Важным компонентом процессарекомбинации является белок TEX15, обеспечивающий связывание белков репарации ссайтами двунитевых разрывов ДНК (Yang et al., 2008). Отсутствие белка TEX15 в половых    12  клетках самцов мыши приводит к накоплению двунитевых разрывов ДНК, нарушениюсинапсиса хромосом, кроссинговера, клеточной гибели и, как следствие, к стерильности(Hamer et al., 2008). Белок MLH1 (The MutL homologue 1) локализован в участкахпрохождения кроссинговера, принимает участие в репарации неправильно спаренныхоснований.

Нарушение функционирования гена, продуктом которого является данный белок,приводит к нарушению формирования хиазм, блокированию сперматогенеза на стадиипахитены – диплотены и отсутствию постмейотических продуктов (Hermo et al., 2010).С начала профазы мейоза и до стадии сперматид в сперматогенных клеткахвыявляются белки пострепликативной репарации HR6A и HR6В, участвующие в репарацииповреждений после репликации. Интересно отметить, что мыши с делецией гена белка HR6Aфертильны, в то время как при делеции гена белка HR6B наблюдается гибель значительногоколичестваклетокнапостмейотическихстадияхиформированиеаномальныхсперматозоидов (Hermo et al., 2010).Ключевую роль в интеграции сигналов от поврежденной ДНК и их дальнейшейпередаче к разнообразным эффекторам играют специфические протеинкиназы, такие какATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated).

В ответ на возникновение двунитевых разрывов ДНКАТМ активируется, фосфорилирует свои мишени, вызывая, тем самым, остановкуклеточного цикла (McKinnon, 2004).Заключительным этапом сперматогенеза является спермиогенез, длительностькоторого у человека в среднем составляет 21,6 дня (Iguchi et al., 2006). В процессеспермиогенеза происходит развитие структур сперматозоида: акросомы, аксонемы, хвоста ишейки, в которой уложена митохондрия (Hermo et al., 2010). Так, в формировании одной изорганелл сперматозоида – акросомы,мембранного пузырька, заполненный ферментами,необходимыми для прохождения оболочек яйцеклетки при оплодотворении (Yoshinaga andToshimori, 2003), участвует аппарат Гольджи.

Для слияния синтезируемых аппаратомГольджи акросомных гранул необходимо взаимодействие белка GRASP65 с белком Golgin95/GM130 (Moreno et al., 2000). Важным белком является HRB, в отсутствии которогонарушается слияние акросомных гранул и происходит формирование округлой головкисперматозоида(Kang-Deckeretal.,2001).Входеспермиогенезаменяетсясоставприлегающей к акросоме плазматической мембраны, что способствует таксису, илинаправленному движению сперматозоида, обеспечивает связывание с ПМ ооцита, а такжеоблегчает разрыв самой мембраны при проникновении сперматозоида в ооцит. Одна из двухцентриолей сперматиды дает начало базальному телу жгутика, откуда формируетсяаксонема.

Митохондрии выстраиваются по спирали вокруг проксимального отделааксонемы. На данном этапе сперматогенеза еще идет синтез мРНК, благодаря которому    13  сперматозоидприобретаетвозможностьиспользоватьновыеисточникиэнергии:ацетилкарнитин, входящий в состав секрета придатка яичка, фруктозу, являющуюсяосновным компонентом секрета семенных пузырьков, а также лактат и пируват,продуцирующиеся эпителиальными клетками женских половых путей.С момента отделения от клетки Сертоли и выхода в просвет семенного канальцапоздняя сперматида называется сперматозоидом. Выход клеток в просвет семенногоканатика, или спермиация, сопровождается деградацией цитоплазматических контактовмежду сперматозоидами.Дозревание сперматозоида происходит и после спермиации.

В придатке яичказавершаетсяформированиеакросомыипроисходитприобретениеподвижностисперматозоидом.В норме за день в яичках образуется около 200 – 300 миллионов сперматозоидов(Hulten, 2004). При этом полный цикл сперматогенеза длится примерно 72-74 дня(Тиктинский, Михайличенко, 1999).1.2.Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов в сперматозоидах  В настоящее время наряду с рассмотренными выше генетическими факторами,выделяют особый класс эпигенетических изменений, привносящих заметный вклад внарушение процесса сперматогенеза (Zamudio et al., 2008).Эпигенетика – наука о митотически и/или мейотически наследуемых измененияхэкспрессии генов или клеточного фенотипа, которые происходят без измененияпоследовательности нуклеотидов в цепочке ДНК (Goldberg et al., 2007).Основныеэпигенетическиемеханизмырегуляциифункционированиягеномавключают: метилирование цитозиновых остатков в молекуле ДНК, модификациигистоновых белков и действие малых регуляторных молекул РНК (miRNA).

Данныемеханизмы регуляции направлены на изменение структурно-функциональных особенностейхроматина и регуляции транскрипции соответствующих генов или целых участков ДНК.Метилирование цитозиновых остатков в молекуле ДНК – одна из наиболее хорошоизученных эпигенетических геномных модификаций. Доказано участие метилирования врегуляции экспрессии отдельных тканеспецифичных генов и генов «домашнего хозяйства»,в поддержании геномной стабильности, репликации ДНК, клеточной дифференцировки,    14  защите генома от мобильных элементов (Паткин, 2008). Метилирование ДНК происходитпосредством добавления метильной группы к 5 положению остатков цитозина вдинуклеотиде 5’-CpG-3’ (Nakao, 2001; Aapola et al., 2004).