Диссертация (Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на ранее эмбриональное развитие человека), страница 2

Действительно, показано, что в20% случаев идиопатического бесплодия, причиной отсутствия беременности являетсяименно нарушение целостности ДНК сперматозоидов (SCSA, 2005). Нарушение целостностиДНК сперматозоида влияет на первые деления дробления зародыша, частоту имплантации инаступления беременности (Shamsi et al., 2008). Одним из основных методов оценкифрагментации ДНК сперматозоидов является метод TUNEL (Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP Nick-End Labelling), или метод флуоресцентного мечения одно- идвунитевых разрывов ДНК. Нарушение целостности генома сперматозоида и егофункционирования, наиболее вероятно, будут приводить к изменениям его морфологии, и,как следствие, к снижению оплодотворяющей способности и ухудшению качестваэмбрионов.Такимобразом,изучениекорреляцииморфологическиххарактеристиксперматозоидов со структурно-функциональными и эпигенетическими особенностями ихгенома является актуальным.

Выявление такой взаимосвязи важно для направленного отборасперматозоидов в условиях искусственного оплодотворения и реализации программвспомогательных репродуктивных технологий.  В связи с этим цель настоящего исследования – оценить взаимосвязь между морфо-функциональными характеристиками сперматозоидов, целостностью их ДНК и уровнем еегидроксиметилирования, а также эффективностью оплодотворения, способностью кразвитию эмбрионов, полученных от пациентов с нормальным и аберрантным кариотипами.Задачи:1.

Провести анализ кариотипа пациентов с нарушением фертильности.2. Провести сравнительный анализ уровня фрагментации ДНК сперматозоидов у пациентовс различными нарушениями параметров спермограммы.    6  3. Проанализировать взаимосвязь между степенью фрагментации ДНК сперматозоидов ипреобладанием различных форм аномалий их головок.4. Проанализировать долю сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов снарушениями конституционального кариотипа.5. Сопоставить уровень фрагментации ДНК с уровнем гидроксиметилирования геномасперматозоидов у пациентов с нарушением фертильности.6.

Оценить влияние нарушения целостности ДНК сперматозоидов на эффективностьоплодотворения и развитие эмбрионов, полученных с помощью вспомогательныхрепродуктивных технологий.Научная новизна:Впервые установлено, что для носителей числовых и структурных нарушенийкариотипа характерно варьирование как уровня фрагментации ДНК сперматозоидов, так ипараметров спермиологического анализа. Уверенно доказано, что увеличение долисперматозоидов с фрагментированной ДНК характерно для пациентов со сниженнымсодержаниемморфологическиморфологическиймаркернормальныхнарушениясперматозоидов.целостностиКромеДНКтого,выявленсперматозоидов–вакуолизированная головка. Впервые показано, что высокий уровень фрагментации ДНКсоответствует высокому уровню содержания гидроксиметилированных сперматозоидов вэякуляте.

Доказано, что нарушение целостности ДНК сперматозоидов не снижаетэффективности оплодотворения, но приводит к нарушению развития эмбрионов прикультивирования in vitro.Теоретическая и практическая значимость:Настоящее исследование выполнено в рамках изучения взаимоотношения генотип фенотипа при формировании сложных признаков. Результаты настоящего исследованиявносятсущественныйвкладвпониманиевзаимосвязимеждуморфологическимихарактеристиками сперматозоидов и структурно-функциональными и эпигенетическимиособенностями их генома.Понимание этой взаимосвязи позволит осуществлять направленную селекциюсперматозоидов, используемых для оплодотворения с целью повышения его эффективностии вероятности развития нормальных эмбрионов.

Результаты проведенного исследованиямогут быть использованы для разработки алгоритма обследования пациентов с нарушениемфертильности, что особенно актуально для пар, прошедших ряд неудачных попыток ЭКО.    7  Положения, выносимые на защиту:1. Частота аномалий кариотипа у пациентов с нарушением фертильности, нуждающихся вприменении вспомогательных репродуктивных технологий, составляет 10,78%.2. Нарушение фертильности у мужчин в 70% случаев обусловлено снижением показателейспермиологического анализа, проведенного в соответствии с нормативами ВОЗ 2010года, и в 95% случаев – в соответствии с нормативами ВОЗ 1999 года.3.

Увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК характерно для пациентовсо сниженным содержанием морфологически нормальных сперматозоидов в эякуляте.4. Вакуолизированная форма головки сперматозоида является морфологическим маркеромнарушения целостности его ДНК.5. Для носителей числовых и структурных нарушений кариотипа характерен широкийдиапазон варьирования как параметров спермиологического анализа, так и уровняфрагментации ДНК сперматозоидов в эякуляте.6.

Для пациентов, в эякуляте которых повышено содержание сперматозоидов сфрагментированнойДНК,характеренвысокийуровеньсодержания5-гидроксиметилированных сперматозоидов.ПубликацииПо материалам исследования опубликовано 25 работ (5 статей и 20 тезисовконференций), в том числе 5 статей в изданиях, рекомендуемых ВАК.    8  ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1.Основные этапы сперматогенеза человека  Сперматогенез - важнейший процесс репродукции человека, в ходе которого изнедифференцированных половых клеток с диплоидным набором хромосом – сперматогоний,в результате одного цикла репликации и двух последовательных митотических деленийобразуются гаплоидные высокоспециализированные клетки – сперматозоиды.Сперматогонии берут начало от первичных половых клеток (ППК), которыепоявляются на ранних этапах эмбриогенеза.

Клетки, потомки которых дают начало гаметам,называются примордиальными. ППК представляют собой диплоидные клетки, способные кмитотическим делениям. Согласно экспериментальным данным (Surani et al., 1986). ППКформируются в проксимальной части эпибласта (первичной эктодермы) под влияниемсигнальных молекул внеэмбриональной эктодермы - продуктов генов Bmp4 и Bmp8b.Первыми маркерными белками ППК являются трансмембранный белок fragilis ицитоплазматический белок stella. Основным геном, с которого начинается эпигенетическоестановление ППК у мышей, оказался ген Blimp1 (B-lymрhocyte maturation induced protein-1).На стадии ранней гаструлы ген Blimp1 экспрессируется только в 4-6 клетках, которыенаходятся в непосредственном контакте с клетками эпибласта.

Мутации в гене Blimp1 ведутк остановке развития ППК. В ППК также активно экспрессируются плюрипотентные геныSox2, Oct-4, Nanas3 и репрессированы гены семейства Нах (Hax1b, Hax1a), которыеопределяют соматическую судьбу клеток.Начиная со стадии гаструлы в хромосомах ППК исчезает метильная метка гистонаН3К9me2,снижаютсяуровниHP1αвэухроматиновыхиперицентромерныхгетерохроматиновых районах (ст.Е9.0).

Происходит снижение общего уровня метилированияДНК, которое коррелирует с репрессией ферментов Dnmt3a и Dnmt3b (Reik et al., 2001;Surani, 2007).Миграция ППК в область зачатка гонад, формирующихся на вентральной сторонемезонефроса, или первичной почки, происходит в основном посредством хемотаксиса. Так,на модельных объектах показано, что в миграции ППК участвуют лиганд kit (Steel, stem cellfactor) и рецептор kit (KIT), а также лиганд CXCL12 и рецептор хемокинов CXCR4 (Ara et al.,2003; Molyneaux et al., 2003). В период миграции численность популяции ППК возрастаетпримерно от ста клеток до пяти тысяч (Афанасьев, 2002). ППК, заселившие зачатки мужскихгонад, называются гоноцитами.

На 18-20 неделе эмбрионального развития гоноцитыпрекращают митотическую активность и вступают в G0 фазу клеточного цикла. Вскоре после    9  рождения митотически делящиеся гоноциты начинают мигрировать к базальной мембранесеменных канальцев, формируя к 12 неделе после рождения пул сперматогониев,возобновляющих активные деления после наступления полового созревания (Yoshida et al.2006). В мигрирующих к базальной мембране семенных канальцев гоноцитах под действиемтранскрипционный фактор SRY, ген которого экспрессируется в соматических клетках покаеще индифферентной гонады, активируется экспрессия гена белка CYP26B1, которыйсвязывается с молекулами ретиноевой кислоты. Данное взаимодействие детерминируетмигрирующий гоноцит к развитию по пути сперматогенной клетки и препятствуетпреждевременному вступлению гониев в мейоз.

В этом процессе также принимают участиефакторы FGF9 и NANOS3 (Bowles et al., 2006; Wilhelm and Koopman, 2006).Процесссперматогенезачеловекахарактеризуетсястрогойвременнойипространственной упорядоченностью. Основные этапы сперматогенеза протекают всеменных канальцах яичек, откуда потом незрелые сперматозоиды выходят в просветканальцев и в составе секрета мигрируют в придаток яичка, где и происходит их полноедозревание.Сперматогенный эпителий лежит на базальной мембране и включает два типа клеток:эпителиальные, играющие вспомогательную роль, и сперматогенные клетки. Эпителиальныеклетки представлены клетками Сертоли, каждая из которых простирается на всю длинуэпителия от базальной мембраны до просвета канальца.

На боковых поверхностях клетокСертоли имеются бухтообразные углубления, в которых размещаются развивающиесясперматогенные клетки. Каждая клетка Сертоли контактирует с пятью другими клеткамитакого же типа и сразу с 40 - 50 сперматогенными клетками на разных стадиях созревания. Впроцессе перемещения созревающих сперматогенных клеток изменяется и морфологияклеток Сертоли: меняется контур и форма, а также перемещается ядро. Такие измененияцикличны и совпадают с созреванием очередной генерации сперматогенных клеток.