Диссертация (Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на ранее эмбриональное развитие человека), страница 11

О. Отта.2.2. Методы2.2.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом из лимфоцитовпериферической крови      Культивирование лимфоцитов периферической крови проводили по стандартнойметодике c модификациями (Кузнецова и др., 1999).В культуральные флаконы добавляли 9 мл среды с глутамином (RPMI, Биолот,Россия), 1 мл эмбриональной сыворотки (Биолот, Россия), 0,6 мл гепаринизированной крови,ФГА в концентрациях, рекомендуемых фирмой-производителем.

Стандартное времякультивирования составляло 72 часа при +37оС в закрытой системе. На 72-м часукультивирования, за 40 мин до начала фиксации, в культуру вводили колхицин (SigmaAldrich, США) в конечной концентрации 8,0 мкг/мл.Содержимое флаконов переносили в центрифужные пробирки, клетки осаждалицентрифугированием в течение 10 мин при 1000 об/мин, супернатант удаляли, оставляя 0,30,5 мл над осадком. Осадок разбивали встряхиванием и добавляли 5 мл гипотоническогораствора (0,55% KCl), перемешивали пипетированием и инкубировали 30 мин прикомнатной температуре.

Проводили префиксацию, добавляя в пробирки по 0,5 млсвежеприготовленного фиксатора (этанол + ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1).    43  Центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин, супернатант удаляли. К осадкудобавляли 5 мл холодного свежеприготовленного фиксатора (этанол + ледяная уксуснаякислота в соотношении 3:1) и перемешивали. Первую фиксацию проводили при -20оС втечение 30 мин. Фиксатор меняли трижды, добавляя порции по 5 мл.Раскапывание суспензии проводили на предметные стекла, нанося по 30-50 мклсуспензии. Стекла высушивали на воздухе при комнатной температуре.2.2.2.

QFH – окрашивание препаратов метафазных хромосом        Препараты инкубировали 10 мин в насыщенном солевом буферном раствореДюльбекко (pH 7,2), затем окрашивали красителем Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, США) (0,5мкг/мл) в течение 20 мин. После препараты инкубировали в свежей порции буферногораствора Дюльбекко в течение 10 мин.С целью контрастирования на препараты наносили по две капли (30 мкл)актиномицина D (Sigma-Aldrich, США), накрывали покровными стеклами и выдерживали втемноте в течение 20 мин. Смывали покровные стекла проточной водой и высушивалипрепараты на воздухе. Наносили на препараты под покровное стекло две каплизаключающего раствора (цитратно-фосфатный буфер Мак-Ильвейна (pH 7,4) и глицерин всоотношении 1:1).2.2.3.

Флуоресцентная гибридизаця in situ      Предобработку препаратов для гибридизации, гибридизацию с зондами, а такжеотмывки препаратов после гибридизации проводили в соответствии с рекомендациямифирмы-производителя зондов.Препараты инкубировали в течение одного часа при +55°С, дегидратировали в серииспиртов возрастающей концентрации (70°, 80°, 96°).    44  Помещали препараты в раствор 2хSSC при 37°С на 5 минут в баню-качалку.Обрабатывали препараты в 0,01% растворе пепсина при 37°С на 5 минут, после чегоотмывали препараты в растворе 2хSSCпри 37°С 5 минут в бане-качалке.Препараты переносили в 2% параформальдегида (Sigma) на 10 минут при комнатнойтемпературе и отмывали препараты в растворе 2хSSC при 37°С в бане-качалке.Споласкивали препараты в воде, проводили через серию спиртов возрастающейконцентрации (70°, 80°, 96°).Гибридизационную смесь готовили в эппендорфовской пробирке по 1 мкл одной изкоммерческих ДНК-проб (Vysis, Abbott Molecular, США), 7 мкл коммерческого входящего внабор для гибридизации буфера и 2 мкл деионизированной воды.Гибридизационную смесь наносили на препараты и накрывали покровными стеклами.Края покровных стекол заклеивали резиновым клеем и помещали препараты в гибридизердля денатурации при температуре 79°С в течение 15 мин.

Переносили препараты вовлажную камеру. Гибридизацию проводили в течение 12-18 часов при температуре +37 °С.После гибридизации удаляли клей пинцетом, снимали стекла в растворе 2хSSC при 37°С, затем промывали в двух сменах 2хSSC при 37 °С в бане-качалке, споласкивали в воде.Препараты проводили по серии спиртов возрастающей концентрации (70°, 80°, 96°),высушивали и заключали в фотозащитный раствор Vectaschield H-1200.2.2.4. Спермиологический анализ      Спермиологический анализ проводили согласно рекомендациям ВОЗ (WHO, 1999,2010).Для определения концентрации и подвижности сперматозоидов использовалисчетную камеру Маклера.

Концентрацию определяли подсчетом количества сперматозоидовв 10 квадратах.По характеру и скорости движения сперматозоидов выделяли категорию А, илипрогрессивно-подвижные (более 25 мкм/с при 37°С), категорию В, или медленныепрогрессивно-подвижные, категорию С (менее 5 мкм/с), или непрогрессивно-подвижные, икатегории D – неподвижные.

При использовании нормативов ВОЗ 2010 года выделялипрогрессивно-подвижные (PR) (категории А + В согласно ВОЗ 1999 г.), непрогрессивно–    45  подвижные (NP) (категория С согласно ВОЗ 1999г.) и неподвижные (категория D согласноВОЗ 1999 г.).Морфологию сперматозоидов оценивали согласно «строгому критерию Крюгера»(Kruger et al., 1986).2.2.5. Методика приготовления препаратов из эякулята      Препараты из эякулята готовили по методике, предложенной Кузнецовой ссоавторами (Кузнецова и др., 1990).Для приготовления препаратов 0,5 мл образца спермы переносили в центрифужныепробирки, добавляли по 8 мл гипотонического 0,038 М раствора KCl с колхицином вконцентрации 2,5 мкг/мл и инкубировали при температуре 37°С в течение 30 минут, послечего осаждали центрифугированием в течение 20 минут при 1500 об/мин и фиксировалиэтанол - уксусным фиксатором (этанол + ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1).Фиксацию проводили в течение 30 минут при температуре 4°С. Затем фиксатортрижды меняли с промежуточным центрифугированием 15 минут при 1500 об/мин.Суспензию фиксированных клеток по 0,1 мл наносили на предметные стекла и высушивалипри комнатной температуре.2.2.6.

Метод TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick-EndLabelling)      Анализ целостности ДНК в головках сперматозоидов методом TUNEL проводили пометодике Негеску с модификациями (Negoescu et al., 1996).Препараты из эякулята проводили через две смены буферного раствора 1хPBS (pH7,4) по 5 минут в каждой при комнатной температуре, затем осуществляли дополнительнуюфиксацию в растворе 4% ПФА в течение 10 минут.Пермобилизацию мембран выполняли в растворе 0,1% цитрата натрия с 0,1% TritonX100 в течение 15 минут при температуре +4º.

Стекла проводили через две смены буферного    46  раствора 1хPBS (pH 7,4) по 5 минут в каждой при комнатной температуре. После этого подпокровное стекло добавляли 4,5 мкл 1хTdT буфера и 0,5 мкл фермента (Roche, Germany) иоставляли на 1 час при +37ºС во влажной камере.Препараты отмывали в трех сменах фосфатного буфера 1хPBS (pH 7,4) в течение 5минут в каждой при комнатной температуре, затем промывали дистиллированной водой ипроводили через серию спиртов в возрастающей концентрации (70°, 80°, 96°).Препараты заключали в фотозащитный раствор Vectaschield H-1200, содержащийDAPI.

Фрагментацию ДНК оценивали по присутствию флуоресцентного сигнала в головкесперматозоида: выделяли сперматозоиды с полностью и частично флуоресцирующимиголовками.2.2.7. Предобработка препаратов из эякулята для иммунуцитохимической детекции 5метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина с помощью антител      Препараты промывали в одной смене фосфатного буфера 1х PBS (рН 7,2) в течение 10минут, затем помещали в 1% водный раствор Triton Х100 с добавлением 0,1 г цитратанатрия. Обработку проводили в водяной бане при +37оС. После этого препараты отмывали вдвух сменах фосфатного буфера 1х PBS (рН 7,2) по 3 минуты в каждой смене при комнатнойтемпературе и споласкивали в воде.Затем препараты обрабатывали в растворе, содержащем 85 мкл 10% пепсина, 90 мкл 2M HCl и 100 мл дистиллированной воды в течение 30 минут при 37оС, отмывали в двухсменах фосфатного буфера 1х PBS (рН 7,2) по 3 минуты в каждой смене. Фиксациюпрепаратов проводили в 2,5% водном растворе параформальдегида в течение 15 минут прикомнатной температуре, затем отмывали в двух сменах фосфатного буфера 1х PBS (рН 7,2)по 3 минуты в каждой смене и один раз в дистиллированной воде в течение трех минут.Препараты проводили через серию спиртов 70, 80, 96% по 3 минуты в каждом и высушивалипри комнатной температуре.

   47  2.2.8. Иммунуцитохимическая детекция 5MeС и 5hMeC с помощью антител напрепаратах из эякулята      Денатурацию проводили в 2 M HCl в течение 40 минут при комнатной температуре.Затем отмывали в двух сменах охлажденного фосфатного буфера 1х PBS (рН 7,2) по 3минуты в морозильной камере и один раз при комнатной температуре в течение 3 минут.Под покровные стекла наносили по 130 мкл блокирующего раствора (Boehringer Mannhiem,Германия) на 1хPBS и инкубировали в течение 50 минут во влажной камере при +37°С.Под покровные стекла на влажные препараты наносили по 100 мкл блокирующегораствора, содержащего антитела к 5-метилцитозину (mouseanti-5-MeC, Eurogentec)иантитела к 5-гидроксиметилцитозину (rabbitanti-5-hMeC, ActiveMotiv) в разведении 1:500 иинкубировали в течение 120 минут во влажной камере при комнатной температуре.