Диссертация (Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на ранее эмбриональное развитие человека)
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на ранее эмбриональное развитие человека". PDF-файл из архива "Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на ранее эмбриональное развитие человека", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст из PDF
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТБИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТКАФЕДРА ГЕНЕТИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ ИРЕПРОДУКТОЛОГИИ ИМ. Д. О. ОТТА»На правах рукописиШильникова Евгения МихайловнаГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНОМАСПЕРМАТОЗОИДА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА РАНЕЕ ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕЧЕЛОВЕКАСпециальность 03.02.07 – генетикаДиссертацияна соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:член-корр. РАН, з.д.н., д.м.н., профессор В.С.
БарановСанкт-Петербург2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................................ 4ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................... 81.1.
ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ СПЕРМАТОГЕНЕЗА ЧЕЛОВЕКА ...................................................................... 81.2. ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В СПЕРМАТОЗОИДАХ ...... 131.3. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ МУЖСКОЙ ФЕРТИЛЬНОСТИ ...................................................... 181.4. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРИЧИНЫ МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ ................................................................. 221.4.1. Нарушения кариотипа .....................................................................................................
221.4.2. Микроделеции Y хромосомы.......................................................................................... 271.4.3. Микроделеции генов аутосомной локализации и генов хромосомы X ...................... 291.4.4. Нарушение расхождения хромосом в мейозе ...............................................................
311.5. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНОМА СПЕРМАТОЗОИДА ......................... 331.5.1. Нарушение компактизации хроматина созревающего сперматозоида ...................... 341.5.2. Повреждение ДНК сперматозоида в результате действия АФК ................................. 351.5.3. Апоптоз в процессе сперматогенеза .............................................................................. 371.5.4. Влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на оплодотворение, качествоэмбрионов и наступление беременности в программах ВРТ .................................................. 38ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ..............................................................................................
422.1. МАТЕРИАЛ ................................................................................................................................... 422.2. МЕТОДЫ....................................................................................................................................... 422.2.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом из лимфоцитов периферическойкрови .............................................................................................................................................. 422.2.2.
QFH – окрашивание препаратов метафазных хромосом................................................ 432.2.3. Флуоресцентная гибридизаця in situ ................................................................................ 432.2.4. Спермиологический анализ ............................................................................................... 442.2.5. Методика приготовления препаратов из эякулята .......................................................... 452.2.6. Метод TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick-EndLabelling) .......................................................................................................................................
452.2.7. Предобработка препаратов из эякулята для иммунуцитохимической детекции 5метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина с помощью антител .......................................... 462.2.8. Иммунуцитохимическая детекция 5MeС и 5hMeC с помощью антител напрепаратах из эякулята ................................................................................................................ 472.2.9.
Анализ препаратов ............................................................................................................. 472.2.10. Статистический анализ .................................................................................................... 48 3 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ................................................................................................................................ 493.1. АНАЛИЗ КАРИОТИПА ПАЦИЕНТОВ С НАРУШЕНИЕМ ФЕРТИЛЬНОСТИ .......................................... 493.2.
СПЕРМИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ У ПАЦИЕНТОВ С НАРУШЕНИЕМ ФЕРТИЛЬНОСТИ ...................... 573.2.1. Повторный спермиологический анализ у пациентов с нарушением фертильности ... 583.2.2. Спермиологический анализ для пациентов с аномалиями кариотипа .......................... 603.3. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА КУЛЬТИВИРУЕМЫХ IN VITRO ЭМБРИОНОВ И ЧАСТОТЫ ПОЯВЛЕНИЯЭМБРИОНОВ С ХРОМОСОМНЫМ ДИСБАЛАНСОМ У ПАЦИЕНТОВ С АНОМАЛИЯМИ КАРИОТИПА.........
623.4. АНАЛИЗ МОРФОЛОГИИ ГОЛОВОК ЭЯКУЛИРОВАННЫХ СПЕРМАТОЗОИДОВ ПАЦИЕНТОВ СНАРУШЕНИЕМ ФЕРТИЛЬНОСТИ ........................................................................................................... 643.5. АНАЛИЗ ФРАГМЕНТАЦИЯ ДНК СПЕРМАТОЗОИДОВ ПРИ НАРУШЕНИИ ФЕРТИЛЬНОСТИ .............. 693.5.1. Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов с учетом формы их головки .................. 733.5.2. Влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на эффективность оплодотворения икачество эмбрионов, культивируемых in vitro ..........................................................................
753.6. ИММУНОДЕТЕКЦИЯ 5-MEC И 5-HMEC В СПЕРМАТОЗОИДАХ ИЗ ЭЯКУЛЯТА ПАЦИЕНТОВ СНАРУШЕНИЕМ ФЕРТИЛЬНОСТИ ........................................................................................................... 773.7. СОПОСТАВЛЕНИЕ УРОВНЯ ФРАГМЕНТАЦИИ С УРОВНЕМ ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ ДНКСПЕРМАТОЗОИДОВ В ЭЯКУЛЯТЕ ПАЦИЕНТОВ С НАРУШЕНИЕМ ФЕРТИЛЬНОСТИ ................................ 794. ОБСУЖДЕНИЕ .............................................................................................................................. 81ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................................................. 91ВЫВОДЫ .............................................................................................................................................
93СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .............................................................................................................. 94СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................................ 95ПРИЛОЖЕНИЕ А ............................................................................................................................ 112 4 ВВЕДЕНИЕ Нарушение сперматогенеза - одна из основных причин бесплодия, частота которогово многих странах, в том числе и в России, достигает 15% (WHO, 2010).
При этом вкладмужского фактора в его этиологию составляет 50-60% (WHO, 2010).В последние десятилетия отмечается значительное ухудшение качества эякулята(Slama et al., 2002; Cooper et al., 2010; Jorgensen et al., 2011; Rolland et al., 2013). Согласноданным Международного андрологического конгресса в большинстве случаев нарушениефертильности у мужчин сопровождается снижением показателей спермиологическогоанализа (Dohle et al., 2010; Jungwirth et al., 2013). Так, согласно проведенным исследованиям,среднее значение концентрации сперматозоидов в эякуляте за последние десятилетияснизилось практически в 1,5 раза (Carlsen et al., 1992; Cooper et al., 2010).
В последнемруководстве Всемирной Организации Здравоохранения по исследованию и обработкеэякулятачеловекареференсныезначенияосновныхпоказателейспермограммы:концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов, существенно снижены (WHO,2010).К нарушению такого сложного и многоэтапного процесса, как сперматогенез,приводят как наследственные, так и экзогенные факторы. Среди наследственных фактороввыделяют нарушения кариотипа, в том числе числовые и структурные аномалии.Хромосомные перестройки затрудняют расхождение хромосом в мейозе, что приводит кснижению спермопродукции, и как следствие, нарушению фертильности. В то же время уносителейструктурныханомалийкариотипаповышеначастотаобразованиянесбалансированных гамет, которые могут принять участие в оплодотворении, увеличиваявероятность появления эмбрионов с хромосомным дисбалансом.
Поэтому своевременныйанализ кариотипа позволит скорректировать стратегию преодоления бесплодия. Другойпричиной снижения фертильности у мужчин являются микроделеции Y хромосомы в локусеAZF. Известно так же, что сперматогенез контролируется более 2 000 генов, мутации вкоторых могут приводить к нарушениям процесса на том или ином этапе. Таким образом,генетические факторы обуславливают до 10-15%, а по некоторым данным до 50%, случаевнарушения сперматогенеза (Ferlin et al., 2007; Ferlin, 2012).Немаловажную роль в нарушении сперматогенеза играют факторы внешней среды,такие как курение, ожирение, стресс. Неблагоприятные факторы внешней среды приводят кобразованию активных форм кислорода (АФК) в клетке, и, как следствие, могут бытьпричиной окислительного стресса.
Последний, в свою очередь, напрямую связан с 5 процессомактивногоэпигенетическихдеметилированиямеханизмовДНК,регуляцииявляющегосяфункциигенов.однимВизосновныхпроцессеактивногодеметилирования происходит превращение 5-метилцитозина в цитозин. При этом в ходепоследовательных биохимических реакций образуются кислородсодержащие производные5-метилцитозина,втомчисле5-гидроксиметилциозин.Дляизучениягидроксиметилирования ДНК разработан ряд подходов, одним из которых являетсяиммуноцитохимическаядетекция5-гидроксиметилцитозинаспомощьювысокоспецифичных моноклональных антител. Использование иммуноцитохимическогоподхода для оценки эпигенетического статуса генома особенно целесообразно при работе сотдельными клетками, в том числе половыми.Другой мишенью АФК является ДНК половых клеток.
