Диссертация (Гены WOX и PIN в регуляции соматического эмбриогенеза у Medicago truncatula), страница 5

Мутация с потерей их функцииприводит не только нарушению формирования ПАМ, но и к формированиюсемядолей без адаксиально-абаксиальной полярности, вся поверхность которыхимеет абаксиальные свойства (Emery et al., 2003). В то же время маркерамиабаксиальной стороны являются ТФ из семейств KANADY (KAN) и YABBY(YAB). Гены KAN1-3, а также гены FILAMENTOUS FLOWER и YAB,принадлежащие к семейству YABBY, экспрессируются в периферических клеткахнижней части эмбриона, а затем — на абаксиальной стороне примордиясемядолей (Bowman, 2000, Kerstetter et al., 2001). Потеря функции генов из группыKANADY и YABBY приводит к формированию увеличенной меристемы инарушению полярности семядолей и, в дальнейшем, листьев.

Например, умутанта kan1 kan2 kan4 из-за аномальных периклинальных делений клетокформируются листоподобные выросты на абаксиальной стороне семядолей и нагипокотиле (Izhaki, Bowman, 2007). Взрослые растения, имеющие множественные24мутации в генах KANADY и YABBY, также характеризуются нарушениемполярности листьев — зачастую они формируют волоски (признак адаксиальнойстороны листа) на абаксиальной стороне листа или же образующиеся листьявообще не формируют листовой пластинки и характеризуются цилиндрическойформой (Eshed et al., 2004).Таким образом, гены, маркирующие абаксиальную сторону семядоли илиста, исходно экспрессируются в основном в латеральных периферическихчастях эмбриона, в то время как адаксиальной стороне семядолей передаютсясвойства медиальной части зародыша (Jenik et al., 2007).1.1.5.

Переход к стадии покоя. ПрорастаниеНаряду с морфогенезом зародыша, существенным этапом эмбриогенезаявляется его созревание. Созревание эмбриона в основном заключается в егоросте, накоплении питательных веществ и переходе к стадии покоя. Основнымигормонами, контролирующими созревание и прорастание семян, являютсяабсцизовая кислота, подавляющая прорастание и обеспечивающая устойчивостьсемени к высыханию, и её антагонисты — гиббереллины. Из ТФ, участвующих впроцессе созревания, наиболее хорошо изучены ТФ из группы LEAFYCOTYLEDON: LEC1, LEC2 и FUSCA3 (FUS3).

Эта группа объединяет два разныхкласса ТФ:LEC1 - субъединица HAP3 транскрипционного фактора, связывающегомотив CCAAT (Lotan et al., 1998), в то время как LEC2 и FUS3 –близкородственные ТФ с доменом B3 (Stone et al., 2001, Luerssen et al., 1998).Доменом B3 обладает также другой ТФ, близкий им по функциям – ABI3(ABSCISICACIDINSENSITIVE3).Всетри генаLECэкспрессируютсяпреимущественно в эмбриогенезе, охватывая и морфогенез, и фазу созревания.

Восновном их функции связаны с созреванием, а также с приданием ткани общихэмбриогенных свойств (Braybrook, Harada, 2008). Например, мутации с потерейфункций LEC1 или FUS3 приводят к потере устойчивости семян к высыханию:для таких семян характерно преждевременное прорастание, и формирующиесяпроростки имеют ряд черт, характерных для уже взрослого растения: в частности,25семядоли таких проростков имеют трихомы (Keith et al., 1994, Lotan et al., 1998).Помимо этого, у мутантов lec1, lec2 и fus3 часто наблюдаются аномальныеделения клеток суспензора в эмбриогенезе (Lotan et al., 1998).

К настоящемувремени выяснено, что мишенями LEC2 и FUS3, а также ABI3, являются генызапасающих белков семени, содержащие в регуляторных областях мотив RY, скоторым и связываются эти ТФ (Mönke et al., 2004, Braybrook, Harada, 2008).LEC1, предположительно, регулирует экспрессию генов запасающих белковпосредством индукции экспрессии генов ABI3 и FUS3 (Kagaya et al., 2005).Помимо генов, кодирующих эффекторные белки, LEC регулируют такжеэкспрессию генов различных ТФ, участвующих в ЗЭ, таких как CUC1, BBM иWRINKLED(WRI1)(Jiaetal.,2014).Другимважнымаспектомихфункционирования является регуляция гормонального баланса: в целом, гены LECявляютсяантагонистамигиббереллинов,стимулирующихпрорастание,иусиливают действие абсцизовой кислоты, действуя по принципу положительнойобратной связи (Braybrook, Harada, 2008).

Кроме того, LEC1 и LEC2 участвуют вметаболизме и сигналинге ауксина, стимулируя экспрессию генов синтеза ауксинагруппы YUCCA, а также регуляторов ауксинового ответа IAA (Braybrook et al.,2006).Для прорастания семени после стадии покоя необходимо репрессироватьгены LEC. В этом процессе участвуют различные ТФ – в частности, ТФ с доменомB3 из группы VAL (VP/ABSCISIC ACID INSENSITIVE3-like) – VAL1 (HSI2),VAL2 (HSL1) и VAL3 (HSL2), которые, как предполагаются, осуществляютрепрессию за счёт привлечения к генам-мишеням деацетилаз гистонов (Zhou et al.,2013). Кроме того, в репрессию генов LEC вовлечены факторы ремоделингахроматина, такие как PICKLE (Zhang et al., 2012), а также комплексы факторов,модифицирующие гистоны - PRC2 (POLYCOMB REPRESSIVE COMPLEX 2),добавляющий репрессирующую метку H3K27me3 (Makarevich et al., 2006), иPRC1 (POLYCOMB REPRESSIVE COMPLEX 1), добавляющий репрессирующуюметку H2AK119ub1 (Kim et al., 2012).261.2.Регуляциясоматическогоэмбриогенезаупокрытосеменных растений1.2.1.

ВведениеРастения всю жизнь сохраняют способность к неограниченному росту засчёт стволовых клеток, находящихся в меристемах. Из-за неподвижного образажизни растения часто подвергаются различным неблагоприятным воздействиямвнешней среды, как биологическим, так и небиологическим, и, вероятно,благодаря этому они смогли развить уникальные по своей широте способности крегенерации.

Растения могут восстанавливать локальные повреждения за счётрегенерации тканей, могут восстанавливать целые органы за счёт органогенеза, нонаиболее экстремальным примером регенерации является развитие de novo целогоорганизма из одной или нескольких соматических клеток – соматическийэмбриогенез (СЭ). Более точно, СЭ — это процесс, при котором незиготическиеклетки формируют эмбрионы, которые проходят через характерные стадииэмбрионального развития, в конечном счёте формируя новое растение (Chen ,2009).СЭ встречается в природе у некоторых видов (например, Kalanchoëdaigremontiana (Garcês, Sinha, 2009) или Malaxis paludosa (Taylor, 1967), однаконамного чаще этот процесс можно наблюдать при культивировании растительныхэксплантов in vitro.

Впервые соматические эмбрионы у растений в клеточнойкультуре in vitro были описаны в середине 50-х годов (Steward et al., 1958). Внастоящее время СЭ широко используется в фундаментальных исследованиях дляизучения регенерации, а также в качестве модели для изучения обычного,зиготического эмбриогенеза (ЗЭ). Методики получения соматических эмбрионов вусловиях in vitro разработаны для большого числа видов растений; в некоторыхслучаяхиспользуютсясуспензионныекультурыклеток,хотяболеераспространены протоколы, в которых процессу СЭ предшествует стадияформирования эмбриогенного каллуса на твёрдой среде.

В некоторых случаяхможно наблюдать прямой СЭ, при котором стадия каллуса отсутствует, и27эмбрионы развиваются непосредственно из клеток экспланта.Обычно процесс развития соматических эмбрионов in vitro можно разделитьна два этапа. Первый этап – индукция, в ходе которой соматические клеткистановятся способными к формированию эмбрионов. Обычно на этом этапекультивирования в среду добавляют различные ростовые регуляторы: основнымиз них является ауксин, однако в некоторых случаях индукцию можноосуществлять с помощью других гормонов – например, цитокинина илиабсцизовой кислоты.Уровни экспрессии многих генов, ассоциированных со стрессовым ответом,повышаются в ходе ранних этапов СЭ, и в качестве индуцирующих СЭ фактороврассматривают также различные стрессовые воздействия: поранение, обработкастерилизующими агентами, дегидратация, изменение pH, сама обработкаэкзогенными гормонами и др.Ранее предполагалось, что в ходе индукции дифференцированные клеткирастения проходят этап дедифференцировки, начинают активно делиться иформируют каллус, на поверхности которого впоследствии сформируютсясоматические эмбрионы; т.е.

теоретически все растительные клетки являютсятотипотентными. Однако, согласно последним данным в большинстве случаевнедифференцированные клетки каллуса и, впоследствии, соматические эмбрионыобразуются из сохранившихся в экспланте стволовых клеток, окружающихпроводящие ткани – клеток перицикла, прилежащих к ксилемным полюсам, илиих аналогов (перицикл является тканью, характерной для корня и гипокотиля,однако аналогичная структура существует и в наземных частях растения)(Sugimoto et al., 2011). При этом в процесс формирования каллуса вовлеченомножество регуляторов, в норме участвующих в формировании корня (Sugimoto etal., 2010).Тем не менее, несмотря на то, что в большинстве случаев ключевую роль вформировании каллуса и соматических эмбрионов играют стволовые клеткипроводящих структур, дифференцированные клетки также могут приниматьучастиевэтомпроцессе: например,дляMedicagotruncatulaописано28формирование соматических эмбрионов из дедифференцированных клетокмезофилла листа (Wang et al., 2011).Таким образом, первый этап СЭ заканчивается появлением в культуреклеток,способныхкформированиюсоматическихэмбрионов.Согласноразличным гистологическим исследованиям, для таких клеток характернынебольшие размеры, крупное ядро и более плотная цитоплазма по сравнению состальными соматическими клетками (Namasivayam, 2007).Второй этап СЭ – непосредственно формирование соматических эмбрионов;для этой стадии в большинстве случаев уже не требуются регуляторы роста, иобычно культивирование проводят на безгормональной среде (Hand et al., 2016).Этот этап во много многом сходен с ЗЭ,однако очевидно, что это сходство неявляется абсолютным по множеству причин.