Диссертация (Влияние глутоксима и моликсана на внутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагах роль каскада метаболизма арахидоновой кислоты и актинового цитоскелета), страница 8

12. Структура арахидоновой кислоты (по Werz, 2002)37После высвобождения из мембранных фосфолипидов судьба АК может быть различной(Piomeli, Greengard, 1990). Во-первых, свободная АК может диффундировать из клетки. Вовторых, она может превращаться в арахидоноил-коэнзим А с помощью арахидоноил-коэнзимА-синтетазы и под воздействием арахидоноил-лизофосфолипидтрансферзы встраиватьсяобратно в мембранные фосфолипиды. Кроме того, АК может подвергаться ферментативномуокислению с образованием биологически активных продуктов - эйкозаноидов (Piomeli,Greengard, 1990).Образование большого количества свободной АК и эйкозаноидов, мощных медиатороввоспаления, является одним из ключевых событий при активации таких иммунокомпетентныхклеток, как макрофаги (Needleman et al., 1986). Они синтезируют и секретируют продуктыметаболизма АК в ответ на многие стимулы, включая факторы, индуцирующие фагоцитоз,иммунные комплексы, факторы комплемента, липополисахариды, бактериальные эндотоксины, иявляются непосредственными участниками воспалительных и аллергических процессов (Scott etal., 1980).

В мембранах макрофагов АК составляет около 25% всех жирных кислотфосфолипидов (Scott et al., 1980). Предполагают, что в макрофагах АК высвобождается измембранных фосфолипидов преимущественно в результате прямого действия ФЛА2 (Balsinde etal., 1990).2.2.1. Структурно-функциональная организация фосфолипаз А2Ключевыми ферментами, осуществляющими запуск каскада метаболизма АК, являютсяфосфолипазы А2 (ФЛА2) (Irvine, 1982). В настоящее время ФЛА2 объединяют в суперсемейство,которое включает 16 групп ферментов (I - XVI), относящихся к нескольким типам, включаясекреторные (secretory, sPLA2), цитоплазматические (cytosolic, cPLA2), Са2+-независимые ФЛА2(Ca2+-independent, iPLA2) и ФЛА2, ассоциированные с ацетилгидролазой фактора активациитромбоцитов/ окисленными липидами и липопротеидами ((Lp)PLA2) (Burke, Dennis, 2009;Dennis et al., 2011).Так, секреторные ФЛА2 относятся к I - III, V, IX – XIII, XIV группам и являютсякомпонентами ядов змей, ящериц, пчёл, моллюсков, а также входят в состав поджелудочногосока и синовиальной жидкости у больных артритом (Burke, Dennis, 2009; Dennis et al., 2011).ФЛА2 группы V (GV, group V) секретируются тромбоцитами и макрофагами (Chakraborti, 2003).Они имеют низкую молекулярную массу (13 – 15 кДа), остаток гистидина в активном центре, атакже 6 консервативных и 1 – 2 вариабельные дисульфидные связи.

Для каталитической38активности секреторных ФЛА2 требуется наличие ионов Са2+, которые связываются с активнымцентром фермента (Burke, Dennis, 2009; Dennis et al., 2011).Установлено, что секреторные ФЛА2 проявляют одинаковую активность в отношениифосфолипидов с различными жирными кислотами в положении sn-2, то есть не обладаютспецифичностью к АК (Burke, Dennis, 2009; Dennis et al., 2011).К цитоплазматическим ФЛА2 относятся представители группы IV. Эти ферменты имеютвысокую молекулярную массу (85 кДа), 9 остатков цистеина и не содержат дисульфидныхсвязей. В пределах группы IV ФЛА2 выделяют 6 подгрупп, которые обозначают как GIVA –GIVF (cPLA2α - cPLA2ζ) (Dennis et al., 2011). Представители подгрупп GIVA и GIVВобнаружены в цитозоле практически всех типов животных клеток, в том числе вмакрофагоподобных клетках человека линии U937, макрофагах мыши линии RAW 264.7 итромбоцитах (Dennis et al., 2011).Первая цитоплазматическая ФЛА2 (GIVA, group IV phospholipase A2) была выделена изтромбоцитов человека в 1986 г.

и в настоящее время изучена наиболее полно (рис. 13) (Burke,Dennis, 2009). GIVA характеризуется наличием в активном центре ключевых остатков серина иаспартата и имеет наибольшую селективность к АК в положении sn-2 мембранныхфосфолипидов. Установлено, что этот фермент состоит из регуляторного С2-домена,связывающегосясмембранами,иα/β-гидролазногодомена,которыйосуществляеткаталитическую функцию (Burke, Dennis, 2009). Последний включает cap-участок илокализованный внутри него lid-участок, который закрывает активный центр ФЛА2. Присвязывании субстрата lid-участок изменяет конформацию, открывая активный центр (Burke,Dennis, 2009).Активность цитоплазматических ФЛА2 регулируется различными факторами. Этиферменты, так же как и секреторные ФЛА2, относятся к Са2+-зависимым эстеразам, но в данномслучае ионы Са2+ нужны не для каталитической активности, а для транслокации фосфолипазы кмембране-мишени (Крутецкая, Лебедев, 1993; Burke, Dennis, 2009; Dennis et al., 2011). Крометого,цитоплазматическиеФЛА2активируютсятакимивторичнымилипиднымимессенджерами, как фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат и церамид-1-фосфат (Burke, Dennis,2009; Dennis et al., 2011).Классическим блокатором секреторных ФЛА2 является 4-бромфенацилбромид (4-БФБ),который необратимо модифицирует (алкилирует) аминокислотный остаток His-48 в активномцентре фермента (Irvine, 1982; Крутецкая, Лебедев, 1993).39Рис.

13.Цитоплазматическаяфосфолипаза А2 GIVA (поBurke, Dennis, 2009)а - кристаллическаяструктура фосфолипазы А2группы IVA. РегуляторныйдоменС2(оранжевый)связывает два иона Са2+(фиолетовый) и церамид-1фосфат(С1Р).Участоксвязывания C1P – C1Pbinding site - отмеченголубым). Каталитическийα/β-гидролазныйдомен(зелёный)включаетактивный центр фермента(ключевые аминокислотныеостатки серина S228 иаспартатаD549идополнительныйостатокаргинина R220 отмеченыкрасным),участоксвязыванияфосфатидилинозитол-4,5дифосфата (PIP2 binding site;синий), а также САРучасток (жёлтый), внутрикоторого находится Lidучасток (пурпурный).б–модельсвязыванияGIVAсмембраной.Показано, что 4-БФБ ингибирует секреторные ФЛА2 из поджелудочной железы и ядакобры (Volwerk et al., 1974; Roberts et al., 1977).

В то же время внутриклеточные ФЛА2 менеечувствительны к действию этого агента. Так, в опытах in vitro 4-БФБ не оказывает существенноговлияния на очищенную Са2+-зависимую ФЛА2 из макрофагоподобных клеток линий P388D1 иRAW 264.7 (Leslie et al., 1988; Glaser et al., 1990).40ФЛА2,экспрессирующиесявразличныхтипахклеток,такжеингибируютсяглюкокортикоидами (глюкокортикостероидами) – природными гормонами надпочечников,регулирующими углеводный и минеральный обмен, а также их синтетическими аналогами(табл. 1) (Крутецкая и др, 1993; Машковский, 2005). Глюкокортикоиды (гидрокортизон,преднизолон, дексаметазон, триамцинолон) являются одними из наиболее эффективныхстероидных противовоспалительных и антиаллергических средств, применяемых при такихзаболеваниях, как хронический ревматоидный артрит, бронхиальная астма, системная краснаяволчанка, а также лимфобластный и миелобластный лейкоз и вирусный гепатит (Машковский,2005).

Глюкокортикоиды оказывают также иммунодепрессивное и антиэдематозное действие. Кэндогенным глюкокортикоидам относятся гормоны коры надпочечников гидрокортизон(кортизол) и кортизон. Синтетический заменитель гидрокортизона преднизолон оказываетпротивовоспалительное действие, примерно в 3 раза более эффективное, чем гидрокортизон.Ещё более активным синтетическим глюкокортикоидом является дексаметазон (Машковский,2005).Известно,чтопротивовоспалительноедействиеглюкокортикоидовсвязаносингибированием освобождения АК – предшественника эйкозаноидов (Lapetina, 1990;Крутецкая, Лебедев, 1993).

Было выявлено, что глюкокортикоиды индуцируют синтез белков,подавляющих активность ФЛА2 (Lapetina, 1990). Эти белки были выделены из различныхклеток (например, нейтрофилы, макрофаги) (Blackwell et al, 1980; Hirata et al., 1980). Припомощи моноклональных антител установлено, что эти белки не только имеют одинаковуюбиологическую активность, но и сходны иммунологически. На основании этих результатов длясемейства белков, активируемых глюкокортикоидами и подавляющих ФЛА2, было предложенообщее название липокортины (Di Rosa et al., 1984).

Затем оказалось, что липокортиныидентичны ещё одной группе белков, представители которой (кальпактины I, II и др.)связывают Са2+ и фосфолипиды, очень многочисленны и широко представлены в различныхтипах клеток. Их функциональная роль до конца не изучена, но предполагается, что онивовлечены в образование контактов между мембраной и цитоскелетом (Goppelt-Struebe et al.,1989).Показано, что синтетический глюкокортикоид дексаметазон эффективно ингибируетФЛА2 в макрофагах мыши (Gewert, Sundler, 1995). Длительная (20 часов) инкубация клеток сдексаметазоном приводила к значительному снижению количества ФЛА2, а также подавлялаактивацию данного фермента и образование свободной АК в ответ на зимозан и форболовыйэфир.

Вероятно, наблюдаемые медленные эффекты дексаметазона на ФЛА2 были обусловленыснижениемобразованияфункциональнойФЛА2натранскрипционномтранскрипционном уровне или активацией её деградации (Gewert, Sundler, 1995).илипост-41Исследован также длительный эффект гидрокортизона на мобилизацию АК и еёпоследующий метаболизм в перитонеальных макрофагах мыши, фибробластах мыши линии L929и макрофагоподобных клетках линии RAW 264 (Wood et al., 1984).

Так, гидрокортизонингибировал как образование свободной АК, так и продукцию эйкозаноидов в клетках L929.Однако в макрофагах и клетках RAW 264 подавление синтеза простагландинов происходило,наоборот, одновременно с усилением мобилизации АК.