Диссертация (Влияние глутоксима и моликсана на внутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагах роль каскада метаболизма арахидоновой кислоты и актинового цитоскелета), страница 5

Структура ингибиторов SERCA Са -АТФаза – тапсигаргин (из Thapsia garganica);б – циклопьязониковая кислота (из Penicillium cyclopium);в – синтетический агент 2,5-ди-(трет-бутил)-1,4-бензогидрохинон (DBHQ).Установлено также, что агонистами депо-зависимого входа Са2+ в различных типахневозбудимых клеток являются соединения, активирующие фосфоинозитидную сигнальную22систему: карбахол (Zhu, Birnbaumer, 1998), пуринергические агонисты АТФ и УТФ (Крутецкаяи др., 2000, 2003), Са2+-ионофоры (А23187, иономицин) (Putney, 2001; Putney et al., 2001),свободные жирные кислоты (в том числе и АК) (Крутецкая и др., 2001).В то же время идентифицированы и агенты, ингибирующие депо-зависимый вход Са2+.Так, прямыми ингибиторами являются неорганические ионы Ni2+, La3+, Gd3+ (Putney, 2001;Крутецкая и др., 2003), нифлумовая кислота (неселективный блокатор катионных каналов)(Крутецкая и др., 2003), 2-аминоэтоксидифенилборат (Putney, 2001; Putney et al., 2001),нифедипин и верапамил (структурно-различные ингибиторы потенциал-зависимых Са2+каналов) (Крутецкая, 2000).2.1.3.1.

Модели депо-зависимого входа Са2+Депо-зависимый вход Са2+ выявлен в различных типах невозбудимых клеток, однакомеханизмы, посредством которого информация об опустошении внутриклеточных Са2+-депопередаётся к депо-зависимым Са2+-каналам, по-прежнему остаются предметом активныхисследований. Для объяснения механизмов депо-зависимого входа Са2+ предложен ряд моделей(рис.

6 - 8).1) Модели с участием водорастворимых вторичных посредниковЦелый ряд исследователей предположили, что при опустошении Са2+-депо в цитозольвысвобождается водорастворимый мессенджер, который диффундирует к плазматическоймембране и активирует вход Са2+ в клетки (Randriamampita, Tsien, 1993; Davies, Hallett, 1995;Kim et al., 1995; Bolotina, Csutora, 2005) (рис.

6а).Одними из первых о существовании посредника, высвобождающегося при опустошенииСа2+-депо, сообщили Рандриамампита и Тьен (Randriamampita, Tsien, 1993). Авторыиндуцировали мобилизацию Са2+ из депо в Т-лимфоцитах линии Jurkat, а затем воздействовалиэкстрактом, выделенным из этих клеток, на макрофагоподобные клетки линии Р388D1, клеткиастроцитомы и фибробласты (Randriamampita, Tsien, 1993). Было установлено, что клетки Jurkatдействительно содержат вещество, активирующее вход Са2+ в других клетках.

Это веществобыло названо фактором входа Са2+ (Са2+ influx factor, CIF) (Randriamampita, Tsien, 1993).Однако выделенный CIF активировал вход Са2+ только при внеклеточном приложении кинтактным клеткам. Кроме того, было выявлено, что экстракт из клеток Jurkat содержитнесколько сигнальных факторов и может активировать как вход, так и мобилизацию Са2+ издепо.23Рис. 6. Предполагаемые механизмы емкостного входа Са2+ (по Putney et al., 2001)а - модель с участием растворимого посредника; б - модель конформационногосвязывания; в - модель встраивания везикул.Ag – агонист; CIF – фактор входа Са2+; CRAC – Са2+-канал, активируемыйвысвобождением Са2+ из депо; ER – эндоплазматический ретикулум; G – гетеротримерный Gбелок; Ins(1,4,5)P3 – инозитол-1,4,5-трифосфат; Ins(1,4,5)P3R – рецептор инозитол-1,4,5трифосфата; PLC – фосфолипаза С; R – рецептор к агонисту; SP – соединительный (scaffolding)белок.Очистка экстракта из клеток Jurkat, обработанных тапсигаргином, при помощихроматографических методов позволила выделить специфический компонент (собственно CIF),активирующий вход Са2+ при микроинъекции в ооциты Xenopus (Kim et al., 1995).

CIF такжеудалось получить из клеток других типов, включая нейтрофилы, макрофагоподобные клеткилинии Р388D1 (Davies, Hallett, 1995), дрожжи Saccharomyces cerevisiae (Csutora et al., 1999) итромбоциты человека (Trepakova et al., 2000).24Нарольвторичныхпосредников,активирующихдепо-зависимыйвходСа2+,выдвигаются различные клеточные молекулы. Так, ряд авторов предполагают, что в передачесигнала об опустошении Са2+-депо могут принимать участие цитохромы Р-450 (эпоксигеназы),локализованные в мембране эндоплазматического ретикулума, или продукт эпоксигеназногоокисления АК 5,6-эпоксиэйкозатриеновая кислота (5,6-ЭЭТК) (Alvarez et al., 1992; Rzigalinski etal., 1999, Xie et al., 2002).

Так, было показано, что 5,6-ЭЭТК активирует депо-зависимый входСа2+ в клетках эндотелия роговицы быка и, таким образом, претендует на роль CIF (Xie et al.,2002). При этом активатор цитохромов-Р450 β-нафтофлавон усиливает депо-зависимый входСа2+, индуцированный различными агонистами в этих клетках (Xie et al., 2002). Кроме того, впользу участия цитохромов-Р450 и их продуктов в передаче сигнала об опустошении Са2+-депок плазмалемме свидетельствуют результаты об эффективном подавлении депо-зависимоговхода Са2+ селективными блокаторами эпоксигеназ (эконазол, проадифен, кетоконазол,миконазол) (Alvarez et al., 1992; Alonso-Torre et al., 1993; Graier et al., 1995).Также в активации депо-зависимого входа Са2+ с участием растворимого посредникаможет быть задействована Са2+-независимая фосфолипаза А2 (Ca2+-independent phospholipase A2,iPLA2), которая относится к группе фосфолипаз А2 VIA (Smani et al., 2004; Bolotina, Csutora,2005).

Каталитическая активность iPLA2 не зависит от ионов Са2+ и ингибируетсякальмодулином (Smani et al., 2004).Согласно предложенной авторами модели (рис. 7) (Smani et al., 2004), CIF, которыйобразуется при опустошении Са2+-депо, устраняет ингибирующее влияние кальмодулина наассоциированную с плазмалеммой iPLA2, которая активируется и начинает расщеплятьмембранные фосфолипиды с образованием лизофосфолипидов и АК.Лизофосфолипиды активируют депо-зависимые Са2+-каналы в плазмалемме и вход Са2+в клетку (Smani et al., 2004; Bolotina, Csutora, 2005).

В результате входа Са2+ в клетку запасыСа2+ в депо восполняются и продукция CIF прекращается. СаМ снова связывается с iPLA2,таким образом, ингибируя образование лизофосфолипидов и, как следствие, депо-зависимыйвход Са2+ (Bolotina, Csutora, 2005). Активность iPLA2 должна жёстко контролироваться,посколькуизбыточнаяпродукциялизофосфолипидовможетпривестикнарушениюцелостности плазматической мембраны и неспецифическому входу Са2+ в клетку из наружнойсреды (Bolotina, Csutora, 2005).Важная роль iPLA2 в активации депо-зависимого входа Са2+ была продемонстрированана клетках различных типов, в том числе клетках гладких мышц, клетках RBL (rat basophilicleukaemia cells, лейкемические базофилы крысы), Т-лимфоцитах линии Jurkat (Bolotina, Csutora,2005).252) Модели «конформационного связывания» (conformational coupling model)Идея о возможности прямого взаимодействия между ЭР и плазматической мембранойвпервые была высказана Р.

Ирвином (Irvine, 1990) на основании выявленной гомологии междуIP3-рецептором и рианодиновым рецептором в скелетных мышцах. Согласно модели Р. Ирвина,IP3-рецептор взаимодействует с некоторым белком в плазматической мембране и играет роль«мостика» между мембраной внутриклеточных Са2+-депо и плазмалеммой. Когда концентрацияСа2+ в депо снижается, IP3-рецептор диссоциирует от мембранного белка и происходит входСа2+ (Irvine, 1990).Данная модель была развита М. Берриджем, который предположил, что связь междуопустошением внутриклеточных депо и входом Са2+ в клетки осуществляется путём прямоговзаимодействия между IP3-рецептором в мембране депо и депо-зависимым Са2+-каналом вплазмалемме (Berridge, 1995) (рис.

6б). Для описания этого взаимодействия М. Берридж ввёлтермин «конформационное связывание» (conformational coupling). В соответствии с моделью,цитоплазматическиедоменыIP3-рецепторов,локализованныеоколоплазмалеммы,интегрируют сигналы, регулирующие емкостной вход Са2+, и передают их депо-зависимымСа2+-каналам в плазмалемме (Berridge, 1995). Таким образом, IP3-рецепторы, вероятно, могутвыполнять две функции: высвобождение Са2+ из депо в цитоплазму и передача сигнала обопустошении депо депо-зависимым Са2+-каналам в плазматической мембране (Berridge, 1995).Чтобы конформационная модель работала, то есть IP3-рецептор и депо-зависимый Са2+канал непосредственно взаимодействовали друг с другом, необходимо, чтобы мембрана ЭРнаходилась в непосредственной близости к плазмалемме (Крутецкая и др., 2003).

Наличиетаких близких контактов подтверждается результатами многочисленных морфологических ииммуногистохимических исследований (Крутецкая и др., 2003). Так, колокализация депозависимого выброса Са2+ и участков выброса Са2+ из депо, индуцированного IP3, показана спомощью конфокальной микроскопии для эндотелиальных клеток (Huser et al., 1999).26Рис. 7. Возможный механизм участия фосфолипазы А2 в активации депозависимого входа Са2+ (по Bolotina, Csutora, 2005 с модиф.)Связывание агониста с рецептором приводит к запуску фосфоинозитидного путипередачи сигнала с участием фосфолипазы С (PLC), инозитол-1,4,5-трифосфата (Ins(1,4,5)P3) ичувствительными к инозитол-1,4,5-трифосфату каналами Са2+-выброса (IP3R) в мембране Са2+депо.