Диссертация (Влияние глутоксима и моликсана на внутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагах роль каскада метаболизма арахидоновой кислоты и актинового цитоскелета)

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТНа правах рукописиНаумова Александра АндреевнаВЛИЯНИЕ ГЛУТОКСИМА И МОЛИКСАНАНА ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ КОНЦЕНТРАЦИЮ Са2+ В МАКРОФАГАХ:РОЛЬ КАСКАДА МЕТАБОЛИЗМА АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИАКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА03.01.02 - биофизикаДИССЕРТАЦИЯна соискание учёной степени кандидатабиологических наукНаучный руководитель:профессор, доктор биологических наукЗоя Иринарховна КрутецкаяСАНКТ-ПЕТЕРБУРГ20172ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .........................................................................................

51. ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................. 72. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................... 112.1.

Механизмы кальциевой сигнализации в невозбудимых клетках ............. 112.1.1. Са2+ - универсальный вторичный посредник в живых клетках ................. 112.1.2. Механизмы мобилизации ионов Са2+ из внутриклеточных депо .............. 142.1.2.1. Са2+-депо невозбудимых клеток ................................................................. 142.1.2.2. Фосфоинозитидный путь передачи сигнала ............................................. 172.1.2.3. Са2+-каналы, активируемые инозитол-1,4,5-трифосфатом ...................... 182.1.3.

Депо-зависимый вход Са2+ в клетку.............................................................. 202.1.3.1. Модели депо-зависимого входа Са2+ ......................................................... 222.1.3.2. Биофизические характеристики депо-зависимых Са2+-каналов ............. 292.1.3.3. Молекулярная природа депо-зависимых Са2+-каналов ............................ 292.2. Арахидоновая кислота и продукты её метаболизма .....................................

352.2.1. Структурно-функциональная организация фосфолипаз А2 ....................... 372.2.2 Каскад метаболизма арахидоновой кислоты................................................. 412.2.2.1. Циклооксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты ............. 442.2.2.2. Липоксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты ................. 462.2.2.3. Эпоксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты ...................

492.2.3. Ингибиторы каскада метаболизма арахидоновой кислоты ........................ 512.3. Структурно-функциональная организация актинового цитоскелета ...... 622.3.1. Структура мономерного и полимеризованного актина .............................. 622.3.2. Реорганизация актиновых филаментов......................................................... 652.3.3.

Актин-связывающие белки ............................................................................ 672.3.3.1. Структура и функции Arp2/3-комплекса ................................................... 672.3.3.2. Структура и функции белков WASP .......................................................... 6932.4. Механизмы редокс-регуляции в клетке .......................................................... 722.4.1.

Система глутатион/окисленный глутатион (GSH/GSSG) – основнаяантиоксидантная система в клетке .......................................................................... 732.4.2. Редокс-регуляция активности клеточных белков ........................................ 792.4.3. Лекарственные средства на основе GSSG .................................................... 852.5. Заключение по обзору литературы и постановка задачи исследования .. 903.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ............................................. 923.1. Объект исследования........................................................................................... 923.2. Растворы ................................................................................................................ 933.3.ИзмерениевнутриклеточнойконцентрацииСа2+спомощьюфлуоресцентного Са2+-зонда Fura-2AM ..................................................................

933.3.1. Экспериментальная установка на базе люминесцентного микроскопа«Люмам-КФ» ............................................................................................................. 943.3.2. Экспериментальная установка на базе флуоресцентного микроскопа LeicaDM 4000B ................................................................................................................... 964.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ...................................................................... 994.1. Влияние препаратов глутоксим и моликсан на внутриклеточнуюконцентрацию Са2+ в макрофагах ........................................................................... 994.2.

Влияние ингибиторов фосфолипаз А2 на Са2+-ответы, вызываемыеглутоксимом и моликсаном ...................................................................................... 994.3. Влияние ингибиторов циклооксигеназ на Са2+-ответы, индуцируемыеглутоксимом и моликсаном .................................................................................... 1034.4. Влияние ингибиторов липоксигеназ на Са2+-ответы, вызываемыеглутоксимом и моликсаном ....................................................................................

1104.5. Влияние ингибиторов эпоксигеназ на Са2+- ответы, индуцируемыеглутоксимом и моликсаном .................................................................................... 1214.6. Влияние ингибиторов актин-связывающих белков на Са2+-ответы,вызываемые глутоксимом и моликсаном в макрофагах ............................. 1282944.7. Возможная роль каскада метаболизма арахидоновой кислоты иактиновогоцитоскелетавдействииглутоксимаимоликсананавнутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагах .......................................

1345. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................... 1416. ВЫВОДЫ ................................................................................................................ 145СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ....................................................................................... 1465СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ4-БФБ – 4-бромфенацилбромид;АК – арахидоновая кислота;АФА (RNS) – активные формы азота (reactive nitrogen species);АФК (ROS) – активные формы кислорода (reactive oxygen species);ГПЭТЕК – гидропероксиэйкозатетраеновая кислота;ГЭТЕК – гидроксиэйкозатетраеновая кислота;ДАГ – диацилглицерол;ЛОГ – липоксигеназа;ЛТ – лейкотриен;НДГК – нордигидрогуаретиковая кислота;НПВП – нестероидные противовоспалительные препараты;ПГ – простагландин;ПКС – протеинкиназа С;ФИК – фосфатидилинозитолкиназа;ФИ3К – фосфатидилинозитол-3-киназа;ФИ4К – фосфатидилинозитол-4-киназа;ФЛА2 (PLA2) – фосфолипаза А2 (phospholipase A2);ФЛС – фосфолипаза С;ЦОГ – циклооксигеназа;СР (SR) – саркоплазматический ретикулум (sarcoplasmic reticulum);ТК – тромбоксан;ЭР (ER) – эндоплазматический ретикулум (endoplasmic reticulum);ЭЭТЕК – эпоксиэйкозатриеновая кислота;Arp2/3 – actin-related protein 2/3 (белок, связанный с актином, 2/3);[Ca2+]i – внутриклеточная концентрация Са2+;CRAC (CRAC-канал) - calcium-release-activated calcium channel (Са2+-канал, активируемыйосвобождением Са2+ из депо);CYP – cytochrome P450 (цитохром Р450);Сys – цистеин;EGF – epidermal growth factor, эпидермальный фактор роста;GSH – восстановленный глутатион;6GSSG – окисленный глутатион;IL – interleukin (интерлейкин);IP3 – inositol-1,4,5-trisphosphate (инозитол-1,4,5-трифосфат);PIP2 – phosphatidyl inositol-4,5-bisphosphate (фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат);SERCA-sarco/endoplasmicreticulumCa2+-ATPase(Са2+-АТФазасарко/эндоплазматического ретикулума);WASP - Wiskott – Aldrich syndrome protein (белок синдрома Вискотта – Олдрича).71.

ВВЕДЕНИЕАктуальность исследования. Фундаментальным регуляторным механизмом в живойклетке является редокс-регуляция передачи сигналов и экспрессии генов (Filomeni et al., 2002;Biswas et al., 2006). Ведущая роль в редокс-регуляции и поддержании редокс-статуса клеткипринадлежит системе глутатион/ окисленный глутатион (GSH/GSSG) (Biswas et al., 2006). GSH(γ-L-глутамил-L-цистеинил-L-глицин)являетсяоднимизключевыхвнутриклеточныхантиоксидантов (Biswas et al., 2006).

Содержание GSSG в цитозоле повышается в условияхокислительного стресса, что послужило основанием рассматривать его как агрессивнуюмолекулу. Однако было показано, что GSSG может оказывать рецептор-опосредованноедействие на внутриклеточные процессы (Filomeni et al., 2002; Townsend et al., 2008).В настоящее время на основе GSSG синтезирован ряд фармакологических препаратов,которые характеризуются иммуномодулирующим и системным цитопротекторным эффектами(Borisov et al., 2001; Жуков и др., 2004).

К этой группе препаратов относятся глутоксим®(динатриевая соль GSSG с d-металлом в наноконцентрации, «ФАРМА-ВАМ», СанктПетеребург) и моликсан® (комплекс глутоксима с нуклеозидом инозином, «ФАРМА-ВАМ»,Санкт-Петербург). Несмотря на широкое использование этих лекарственных препаратов вмедицинской практике, клеточные и молекулярные механизмы их действия остаются во многомне изученными.Одной из основных мишеней действия глутоксима и моликсана являются такиеиммунокомпетентные клетки, как макрофаги (Еремеев, Гергерт, 2013). Ранее на кафедребиофизики Санкт-Петербургского государственного университета (СПбГУ) было впервыепоказано, что GSSG, глутоксим и моликсан вызывают увеличение внутриклеточнойконцентрации Са2+, [Ca2+]i, связанное с мобилизацией Са2+ из внутриклеточных тапсигаргинчувствительных Са2+-депо и последующим депо-зависимым входом Са2+ в перитонеальныемакрофаги крысы (Крутецкая и др., 2007; Курилова и др., 2008, 2011а, б).

Установлено также,что в действии глутоксима и моликсана на [Ca2+]i в макрофагах принимают участие такиесигнальные молекулы, как тирозинкиназы и тирозинфосфатазы (Крутецкая и др., 2007;Курилова и др., 2008), ФИ3К и ФИ4К (Крутецкая и др., 2008), ключевые ферментыфосфоинозитидного пути передачи сигнала ФЛС и ПКС (Крутецкая и др., 2009), элементыцитоскелета (Крутецкая и др., 2011; Курилова и др., 2012а, б; Крутецкая и др., 2013; Kurilova etal., 2013; Миленина и др., 2014), рецепторы, ассоциированные с гетеротримерными G-белками(Krutetskaya et al., 2014), малые G-белки суперсемейства Ras (Крутецкая и др., 2014).8В ходе иммунного ответа активированные фагоциты продуцируют большие количествасвободной арахидоновой кислоты (АК), которая высвобождается из мембранных липидов сучастием фосфолипаз А2 и далее легко окисляется в клетке по трём основным ферментативнымпутям с участием циклооксигеназ, липоксигеназ и цитохром Р-450-подобных эпоксигеназ(Needleman et al., 1986; Lapetina, 1990; Крутецкая, Лебедев, 1993; Dennis et al., 2011).