Автореферат (Физические методы адресации биологически активных веществ в живых системах с использованием полимерных микроносителей), страница 3

В рамках данной диссертационной работы использовалась клеточнаялиния MA-104 (эмбриональная почка, макака резус). На следующий деньзаменялась клеточная среда и добавлялась суспензия микрокапсул присоотношениях 5 и 100 капсул на единичную клетку.Клеткипомещалисьв24или96-луночныепланшеты.Клеткиинкубировались (Innova CO-170, New Brunswick Scientific) в течение 4 часовпри температуре 370С вместе с добавленными капсулами.14Рис .9. СЭМ изображения флуоресцентных магнитных микрокапсул (а,б).Изображения микрокапсул полученные методом конфокальной микроскопии (в).Рис .10.

3D реконструкция флуоресцентных изображений клеток МА-104 синтернализованными микрокапсулами. Клетки меченые кальцеином (а); TRITCфлуоресценция микрокапсул (б); положение капсул в живое клетке (в).Эксперимент показывает способность метаболически активных клетокпревращать реагент AlamarBlue в флуоресцентный колориметрическийиндикатор. Далее в каждую лунку клеточного планшета добавляли 10 мклфлуоресцентного красителя (AlamarBlue, Sigma-Aldrich) и затем измерялиБ)А)Рис .11 Тест цитотоксичности микрокапсул для клеточной линии МА-104 (а).Распределение магнитного поля в зазоре электромагнитного пинцета (б).спектрофотометром (Gemini XPS Microplate Reader, Molecular Devices)интенсивность свечения клеток (Рис.

11а). Смесь живых клеток MA-104 в15специальном клеточном питательном растворе прокачивалась через стеклянныйканал с помощью шприцевой помпы (объемный расход 200 мкл/с).А)Б)В)Г)Рис 12. Экспеимент по магнитному захвату клеток МА-104 с магнитными микрокапсулымив стеклянном капилляре, при помощи магнитного пинцета (а). Карта распределения магнитнойиндукции (б). Поля скоростей до и после магнитного захвата (с) и (д).Капилляр был помещен в зазор между наконечниками магнитногопинцета таким образом, что тень нижнего наконечника не перекрывает полезрения микроскопа в области потока суспензии клеток.

После заполнениякапилляра клеточной суспензии, электромагнит включался, в результате чего взоне наибольшего напряжения магнитного поля захватывался массив клеток.На рисунке 12 представлена клеточная колония, образованная градиентныммагнитным полем. Время магнитного воздействия составляло 5 секунд.

Нарисунке 12Б представлена карта пространственного распределения магнитнойиндукции магнитного пинцета относительно захваченной колонии клеток.Показано, что клеточная колония сформирована в зоне с градиентоммагнитного поля порядка 180 Т/м. Карта скорости потока суспензии клеток встеклянном канале до и после магнитного воздействия представлена на рисунке1612в,г. После формирования клеточной колонии (MA-104) стеклянный канал склетками помещался в чашку Петри с питательной средой.Рис 13.

Клеточная колония 24 и 96 часов после эксперимента.В течение пяти дней, рост клеток контролировался с использованиемкальцеинового красителя и флуоресцентной визуализации. На рисунке 13а,впоказаны захваченные клетки в стеклянном канале через 24 и 96 часов послеэксперимента соответственно.В Главе 5 проведено исследование процессов фототермическоговоздействиялазерногоИКизлучениянаполимерныетрёхмерныемикроструктурированные плёнки с массивом полых МК на их поверхностичерез многомодовое оптическое волокно, в фантоме мягких тканей.Б)А)В)Рис 14. Процесс изготовления полимерной плёнки с массивом полых трёхмерныхконтейнеров, методом полионионной сборки (А).

Сэм изображения ПТМП (Б).Флуоресцентные изображения ПТМП (В)Полимернаятрёхмернаямикроструктурированнаяплёнкаизготавливалась в пять этапов (рисунок 14) Сначала метод лазернойтрёхмерной литографии изготавливалась положительная кремниевая мастер17маскасмассивомодинаковыхвыпуклыхэлементов.Сполученнойположительной мастер-маски делался негативный оттиск при помощиполидиметилсилоксана (ПДМС).

Затем на ПДМС матрицу адсорбировалось 40бислоёвразнозаряженныхполиэлектролитовPDADMAK/PSSметодомпоследовательной адсорбции.б)a)Рис 15. Характерные паттерны фототермического повреждения сухих полиэлектролитныхтрёхмерных плёнок после воздействия ИК излучением, подведённым через оптическоемногомодовое волокно (а). График зависимости диаметра зоны повреждения полимернойплёнки от плотности энергии лазерного излучения (б).Наследующемгерметизироваласьэтапепористаягидрофобным0,5%поверхностьрастворомполиэлектролитовPLA.Врезультатеполучалась гидрофобная плёнка с массивом вогнутых лунок, в которыепомещался Родамин В изоцианат (RITC) посредством метода осаждениявещества из жидкой фазы.

Для герметизации карго, полимерная плёнкапереносилась на покровное стекло, с PLA покрытием, методом микропечати.На внешнюю поверхность плёнки напылялись в вакууме частицы золота припомощи коммерческой системы напыления. Единичный МК имел формуусечённого конуса высотой 4 мкм и диаметрами оснований 10 мкм и 7 мкмсоответственно. В среднем, каждый контейнер может содержать порядка 10 пгбиоактивного вещества, что в сумме даёт 360 мкг на 100 мкм2 площадиполимерной плёнки.На первом этапе сухая ПТМП активировалась в воздушной среде. ПТМПпомещалась на предметный столик инвертированного микроскопа.

Затемоптическое волокно располагалось ортогонально к образцу на высоте 100 мкм.18а)б)Рис 16. Конфокальные изображения PSS/PDADMAC ПТМП в 1% агарозном геле послелазерного ИК воздействия через многомодовое оптическое волокно (3D реконструкция).Плотностью мощности лазерного воздействия составляла 5,6 кВт/см2. Красный каналфлуоресценции (а) соответствует свечению инкапсулированного RITC. Зелёный каналфлуоресценции (б) соответствует свечению FITC растворённого в 1% агарозном геле.Распределение флуоресцентного сигнала на (б), является перевёрнутым в пространствеотносительно оси Z таким образом, что центральная выпуклая область (б) флуоресцентногосигнала FITC “накрывает” вогнутую область расплавленной полимерной плёнки (а).Время воздействия лазерного излучения составляло 0,5 с (Рис.

15а).Затем плёнка активировалась в деионизированной воде и в 1% агарозном геле.Оптическое волокно вводилось в агарозный гель под углом 600 на расстоянии100 мкм от поверхности плёнки. В зоне лазерного воздействия наблюдаетсякруговая область фототермического повреждения (рисунок 16а,б).Рис. 17. Зависимость между количествомповрежденных МК PSS/PDADMAC ПТМПи плотностью мощности ИК излучения(расстояние 100 мкм).

Черные столбики количество повреждённых сухих МК,красныестолбикиколичествоповреждённых МК в деионизированнойводе, синие столбики - количествоповреждённых МК в 1% агарозном геле.Пространственная 3D реконструкция флуоресцентного сигнала RITC иFITC показала, что произошло плавление и деформация полимерной плёнки(Рис. 16а). В центральной части зоны лазерного ИК воздействия образоваласьвпадина,окружённаявыпуклымкольцом,сформированнымсмесьюрасплавленного полимера и флуоресцентного преципитата RITC (рисунок 16д).Сформированная впадина была заполнена гидрогелем с красителем FITC(рисунок 16б).19В Главе 6 продемонстрирован метод адресации биологически активныхвеществ к единичным клеткам при помощи фототермической ИК активациимикроструктурированныхнаноплёнок.Целямиданнойработыбылоиспользование ПТМП плёнки в качестве клеточного субстрата, для экспрессииспецифических доксициклин-зависимых генов зелёного флуоресцентного белка(ЗФБ), единичных модифицированных клеток С2С12, посредством целевойфототермическойактивацииуединённыхмикроконтейнеровПТМПсинкапсулированным доксициклином.Рис 18.

Схематическоепредставление основных этаповсинтеза PLA биополимернойПТМП посредством методамикропечати (а), СЭМизображения пустой негативнойPLA матрицы, до процессамикропечати (б), СЭМизображения PLA матрицы, допроцесса микропечати, спреципитированнымикристаллами доксициклина (в),пустая ПТМП плёнка с С2С12клеточной колонией (г), ПТМПплёнка с доксициклином и сС2С12 клеточной колонией (д)В результате ЗФБ модифицированные клетки С2С12, после воздействиядоксициклина (DOX) активируют экспрессию ЗФБ посредством тетрациклинзависимого промоутера Ptet, активированного rtTA-2SM2, который в своюочередь активно отключается в отсутствие DOX путём связывания репрессораtet-R-KRAB. Для изготовления ПТМП с массивом полых МК, использовалсябиополимер PLA (гранула 3 мм, Mw ~ 60 000, Sigma-Aldrich, Германия).

ПДМСмаска погружалась в 0,5% раствор PLA, после чего в полученные лункипреципитировались биологически активными вещества и затем плёнкапечатались на поверхность покровного стекла с PLA покрытием. Количествоинкапсулированного вещества в единичный МК полимерной трёхмерной PLA20плёнки составило 12,5 ± 6 пг флуоресцентного красителя RITC или 2± мкгактивного вещества на 1 см2 (160.000 МК). Для того, чтобы 3D плёнкувозможно было активировать ИК лазерным излучением, на поверхность ПТМПнапылялись в вакууме золотые наночастицы (SC 7620, Quorum, Laughton,Великобритания).Рис 20. Дизайн эксперимента по фототермической активации экспрессии ЗФБединичных генетически модифицированных клеток на ПТМП клеточном субстрате (а), 10хсветлопольное изображение ПТМП с клеточной колонией, до лазерного воздействия (б),зона лазерного воздействия на единичный микроконтейнер ПТМП возле С2С12 клетки, дофототермической активации (в),зона лазерного воздействия на единичныймикроконтейнер ПТМП возле С2С12 клетки, после фототермической активации (г),конфокальные флуоресцентные изображения прокрашеных ядер и цитоскелета клеточнойколонии в зоне фототермической активации микроконтейнера ПТМП (д), конфокальныефлуоресцентные изображения ЗФБ клеточной колонии в зоне фототермической активациимикроконтейнера ПТМП (е), наложение флуоресцентных каналов (ж).Чтобы избежать высвобождения избыточного количества DOX, следуетизбегать активации нескольких близлежащих МК и сохранять минимальноерасстояние порядка двух МК друг от друга.

Активация сразу несколькихсоседних МК ПТМП приводило к экспрессии ЗФБ в не целевых клетках в полезрения микроскопа. Другие расхождения между позицией флуоресцентных21клеток и активированным МК объясняются миграцией клеток, которая можетсоставлять до 15 мкм.В Заключении сформулированы основные результаты и выводы работы.Основные результаты диссертационной работы заключаются в следующем:1.

Разработана и апробирована методика адресации флуоресцентныхмногослойных микрокапсул в потоке крови in vivo при помощиэлектромагнитного пинцета в пределах выбранного сосудистого сегмента сетикровеносных сосудов. Было показано, что многослойные микрокапсулызахватывались магнитным пинцетом в сосудистых сетях брыжейки крысы взонах с наличиями изгибов и ветвлений сосудов.