Автореферат (Физические методы адресации биологически активных веществ в живых системах с использованием полимерных микроносителей), страница 2

Основные результаты диссертационнойработы были опубликованы в высокорейтенговых научных журналах, пройдянезависимую экспертную оценку (ACS applied materials & interfaces – IF –67.504; Journal of Controlled Release IF – 7.786). Представленные результатынаходятся в соответствии с результатами, полученными другими авторами,работающих в области нано- и биомедицинских технологий.Апробация работОсновные результаты работы были представлены на научных семинарах,научных школах, всероссийских и международных конференциях, в том числе:1.Kurochkin M.A., Timoshina P.A., Fedosov I.V., Tuchin V.V.,” Study of thermal sourcelight spatial coherence” SFM 2011, Saratov State University, Saratov, Russia.

2.Kurochkin M.A.,Timoshina P.A., Fedosov I.V., Tuchin V.V.,”Particle Image Velocimetry for blood micro circulatestudies” SFM 2012, Saratov State University, Saratov, Russia. 3.Kurochkin M.A, “ Cистема дляприжизненнойцифровойвизуализацииимикроанемометриикапиллярногокровотока”УМНИК, Устный доклад, SSU, Russia, 2013. 4.Kurochkin M.A., Fedosov I.V.,Tuchin V.V.,” Real time Particle Image Velocimetry for blood microcirculation studies” SFM 2013,Saratov State University, Saratov, Russia. 5.Kurochkin M.A., Fedosov I.V., Tuchin V.V.,”Advanced digital image processing for \textit{in vivo} capillaries network flux analysis” SFM2014, Saratov State University, Saratov, Russia.

6.Kurochkin M.A., Timoshina P.A., Fedosov I.V.,Tuchin V.V.,” Advanced digital image processing for in vivo analysis of blood flow in capillarynetwork,” Asia Communications and Photonics Conference (ACP), China, Shanghai, 2014.7.Курочкин М.А., Тимошина П.А., Федосов И.В., Тучин В.В.,” Прижизненная цифроваямикроскопия для анализа динамики кровотока в сети капилляров,” VII Съезд Российскогофотобиологического общества, Россия, пос. Шепси, 2014.

8.Е.С. Стюхина, М.А. Курочкин,И.В. Федосов, В.В. Тучин, Д.Э. Постнов, «Оценка динамических характеристиккапиллярного кровотока методами окклюзионной фотоплетизмографии и капилляроскопии»,материалы VII съезда Российского фотобиологического общества, Пущино, 92 (2014).9.Kurochkin M.A., Fedosov I.V., Tuchin V.V., “Computational side of micro-circulationassessment by PIV,” Saratov Fall Meeting – SFM’14 Microscopic and Low-Coherence Methods inBiomedical and Non-Biomedical Applications VII, Russia, Saratov, 2015.Личный вкладБольшая часть экспериментальных результатов была получена личносоискателем, а также совместно с коллегами научных групп в рамкахсотрудничества при выполнении совместных проектов.

Вклад соискателявключает: разработка и апробация методов магнитной адресации полимерныхмагнитных микрокапсул in vitro и in vivo при помощи магнитного пинцета;разработка и апробация методов магнитного захвата клеток, поглотившихмагнитные микрокапсулы, в стеклянном капилляре; разработка методовморфологического анализа васкулаторных сетей на основе корреляционныхалгоритмовPIVанализа;изготовлениеполимернойтрёхмерноймикроструктурированной плёнки с массивом МК на её поверхности иоптической системы лазерного ИК воздействия через многомодовое оптическое7волокно для фототермической активации групп МК в фантоме мягких тканей;разработка и апробация методов фототермической адресации биологическиактивныхвеществкединичнымклеткам,наполимерноймикроструктурированной клеточной положке.ПубликацииПо материалам диссертации опубликовано 12 научных работы в изданиях,включенных в перечень рекомендованных ВАК, получено 3 свидетельства обинтеллектуальной собственности.Объем и структура работыДиссертация состоит из введения, шести глав, заключения, спискаиспользованных источников (155 наименования), списка сокращений и спискарисунков.

Диссертация изложена на 152 страницах и содержит 59 рисунков.Основное содержание работыВоВведенииобоснованаактуальностьтемыдиссертации,сформулирована её цель и основные задачи, описаны научная новизна ипрактическаязначимостьработы,приведеныосновныеположенияирезультаты, выносимые на защиту, описано краткое содержание, структура иобъем диссертации, апробация работы и личный вклад автора.В Главе 1 рассмотрены полимерные многослойные микроносители,применяющиеся для адресной доставки биологически активных веществ кцелевым участкам живых систем, при помощи неоднородного магнитного поля.Описана методика функционализации, инкапсуляции и синтеза многослойныхполимерныхмикроносителейпоследовательнойадсорбции(микрокапсулиразнозаряженныхплёнок)парпосредствомполианионовиполикатионов, а также рассмотрены методы прижизненной визуализации сетейкровеносных сосудов.В Главе 2 представлен метод расчёта полей скорости крови при помощикорреляционного PIV анализа.

Концентрация эритроцитов в различныхучастках капилляра неоднородна, и поэтому движение крови в капилляре8хорошо заметно в виде перемещения участков различной яркости вдоль осевойлинии капилляра. Это явление позволяет оценить скорость течения крови вкапилляре, используя корреляционные алгоритмы.Рис.1.Треугольникамсзаполнениемсоответствуютизмеренные значения скоростиповодномумениску.Треугольникам без заполнениясоответствуютрасчётныезначения скорости методомPIVанализа.Прямаялинейнаярегрессияизмеренныхзначенийскорости.Точность алгоритмов PIV анализа апробировалась на модели кровеносногососуда, который был изготовлен из цилиндрического стеклянного канала свнутренним диаметром 50 мкм, закреплённого на предметном стекле.

Размерчастиц-трассеров составлял 1,5 мкм. Давление в системе изменялось с шагом в10 мм вод. ст. Во время каждого измерения регистрировалась серияизображений движения частиц-трассеров в капилляре диаметром 50 мкм, атакже движение водного мениска в концевой стеклянной трубке диаметром 1мм. Скорость движения водного мениска соответствует средней скороститечения в канале, а скорость частиц трассеров в центральной части канала –максимальной скорости течения в нем.

Таким образом, объём жидкости,протекающей через поперечное сечение потока в единицу времени:,где(2)- средняя скорость потока, - площадь поперечного сечения потока.Согласно формуле 2 средняя скорость в капилляре будет в 400 раз большесредней скорости потока во вклеенной в канал цилиндрической трубка. Дляламинарного течения в цилиндрической трубе справедливо равенство:,,гдеизмерялось(3)- максимальное значение скорости потока. Методом PIVмаксимальноезначениескорости9исогласноформуле3рассчитывалось среднее значение скорости потока суспензии микросфер.Данные расчёта скорости движения частиц-трассеров нормировались исопоставлялись со средним значениями скорости водного мениска (Рис. 1).Рис.

2. Изображениекапиллярной сетихориоаллантоисная оболочкакуриного эмбриона (а). Маскакапиллярной сети (б).Адаптивное PIV по рассчитанноймаски капиллярной сети (в).Увеличенный сегментизображения (г)Далее метод PIV адаптировался для in vivo измерения скорости крови вкровеносных сосудах и апробировался на сети сосудов хориоаллантоиснойоболочки (ХАО)12-14 дневного куриного эмбриона. Чтобы отделить участкикапиллярной сети от неподвижного фона использовался адаптивный алгоритмНиблэка, который основывается на расчёте локального среднего значение истандартное отклонение интенсивности элементов изображения в пределаханализируемого окна.(4), где T(x,y) - является локальным порогомT(x,y)=m(x,y)+ks(x,y)бинаризации, m(x,y) - среднее значение яркости участка изображения, s(x,y) стандартноеотклонениезначенияяркостиизображениявнекоторойокрестности рассматриваемой точки, k – коэффициент Ниблэка. Далееэлементы изображения, характеризующие шум, компенсировались операциейэрозии,применённойдлявсегоизображения.Бинарноеизображениепроверялось на устойчивость к 10 итерациям эрозии для удаления точечныхэлементов изображения (Рис.

2б).10Рис.3.Сплошнаялиниясоответствуетнормированному измеренному поперечномупрофилю скорости крови PIV методом вобозначенной зоне рис. 2г. Пунктирная линиясоответствуетпараболическомунормированномупрофилюскоростиламинарного потока жидкости по Пуазейлю.В результате оставались лишь те участки изображения, что соответствуютучасткам разветвлённой сети капилляров.

Расчётные зоны PIV анализарасполагались равномерно по полученной маске сети кровеносных сосудов, чтопозволило измерять абсолютные значения скорости крови в пределахсосудистых ветвлений (Рис.2в,г), игнорируя движения элементов изображениявне границ кровеносной сети. На рисунке 3 представлен профиль скоростикрови, полученный адаптивным PIV методом в зоне, указанной на рисунке 2г.В Главе 3 впервые продемонстрирован метод магнитного захватамногослойных микрокапсул в биологических тканях.Многослойные микрокапсулы (Рис. 4а,б) приготавливались посредствомметодапоследовательногоионногонаслоенияразнозаряженныхполиэлектролитов PAH и PSS на ядрах CaCO3 с добавлением 2,5 мл раствораRITC-BSA.

Для того, чтобы капсулы реагировали на магнитное поле, вместоодного из слоев PSS наносился слой наночастиц Fe3O4 (0,5 мг/мл), адополнительные слой RITC-BSA добавлялась к общему числу слоёв оболочкикапсулы для увеличения её общего флуоресцентного сигнала. Концентрацияполученной суспензии микрокапсул была рассчитана с помощью счетнойкамеры (гемоцитометр) и составляла 2,45×108 мл-1.Белая стрелка обозначает направление потока кровотоки (Рис.

5а). Белыепятна во всей области потока соответствуют свечению микрокапсул. Большоебелое пятно на капиллярной стенке соответствует агрегату микрокапсул,образованному под воздействием неоднородного магнитного поля. Накоплениекапсул вблизи магнитного наконечника является явным свидетельством ихмагнитногооткликананеоднородное11магнитноеполе.Капсулыаккумулируются точно в области наибольшего магнитного поля, где онодостигает значениям 200 мТл (Рис. 5б˗г).Рис.

4. Схематическое представление структуры оболочки магнитных флуоресцентныхмикрокапсул (а) и их конфокальное изображения (б). Электромагнитный пинцет (с).Эти данные позволяют нам оценить приблизительное количествозахваченных капсул и, следовательно, динамику их накопления. СогласноСЭМ-изображениям, средний размер капсулы составляет около 3 мкм, чтосоответствует площади 7 мкм2. В свою очередь, площадь агрегатов капсулможет быть представлена как сумма прямоугольников и прямоугольныхтреугольников.

Таким образом, можно вычислить, что около 2700 капсулбыли захвачены за первые 30 секунд, а затем около 2800 капсул за 60 с идалее около 4500 капсул за 90 секунд магнитного воздействия. Экспериментыin vivo по визуализации и захвату капсул в кровотоке проводились на сосудахбрыжейки: артериолах, венулах и капиллярах (Рис. 6а-е).

Дальнейшиеэксперименты in vivo показывают, что капсулы обычно захватываютсямагнитным полем в изгибах и бифуркациях кровеносных сосудов (Рис. 6г-е),где капсулы замедляются, попадая в пристеночные потоки плазмы крови, чтов свою очередь способствует их механическому проникновению в стенкуданного сосуда.

На рисунке 7 представлен гистологический срез участкабрыжейки крысы после введения микрокапсул и их магнитного захвата. Наданном гистологическом срезе можно четко различать продольное сечениебольшой вены, её стенок (Рис. 7а), эритроциты (Рис. 7б) и небольшихкапилляров (Рис. 7г). На данном гистологическом срезе отчётливо видно, что12накопление микрокапсул происходит вдоль стенки большого сосудов, но ссохранением просвета данной вены.Рис. 5 Визуализация in vitro микрокапсул,движущихся в потоке цельной крови крысыбез магнита (a), улавливание капсул спомощью постоянного магнита через 30, 60и 90 с после применения магнитного поля(б˗г) и соответственно (д и е) - послеудаления магнита.

Капсулы хорошо видны ввиде белых областей вблизи стекляннойкапиллярной стенки.Рис 6. Визуализация in vivo и захватмикрокапсул в сосудах брыжейки; (a-в)захватакапсулвY-разветвленноммикрососуде:(a)светлопольноеизображениемикрососудов(б)флуоресцентый канал визуализации надлине волны возбуждения 532 нм (в)комбинированное изображение сосудов ифлуоресценциимикрокапсул;(г˗е)Дополнительные эксперименты in vivo позахвату капсул в изгибах и бифуркацияхмикрососудистого русла брыжейки (желтыелиниинаг-еобозначаютстенкумикрососуда).Также показано, что капсулы проходят в небольшие брыжеечныекапилляры (Рис.

7г). Вставка на рисунке 7 показывает увеличенный участокстенки вены (Рис. 7е). Видно, что небольшая часть капсул проникает черезэндотелий в стенку кровеносного сосуда. Показано, что магнитная локализация13микрокапсул в биоткани не блокирует кровоток в крупных сосудах, чтоподтверждается на гистологических срезах (Рис. 7) и посредством PIV анализакровотока до и после воздействия градиентного магнитного поля (Рис. 8). Этоможно объяснить неоднородностью магнитного поля в зазоре междумагнитами, которое притягивает капсулы к противоположным краям сосуда.Рис 7. Типичный гистологический срезбрыжейки крысы после магнитногозахвата капсул: (а) стенка вены,отмеченная желтыми линиями; (б)эритроциты;(в)агломерациямикрокапсул; (г) небольшой капилляр,заполненныймикрокапсулами;(е)микрокапсулыпроникшиечерезэндотелий в стенку вены в зоне (д).Рис.8.Картараспределения скоростикрови в сети сосудовбрыжейки крысы до (а) ипосле (б) магнитногозахвата микрокапсул припомощиэлектромагнитногопинцета.В Главе 4 продемонстрирована методика формирования жизнеспособнойклеточной колонии в стеклянном канале посредством магнитной локализацииклеток, поглотивших магнитные микрокапсулы, при помощи магнитногопинцета.