Автореферат (Физические методы адресации биологически активных веществ в живых системах с использованием полимерных микроносителей)

На правах рукописиКурочкин Максим АндреевичФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АДРЕСАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХВЕЩЕСТВ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМПОЛИМЕРНЫХ МИКРОНОСИТЕЛЕЙСпециальность 03.01.02 — БиофизикаАВТОРЕФЕРАТдиссертация на соискание учёной степеникандидат физико-математических наукСаратов – 2018Работа выполнена на кафедре оптики и биофотоники Федеральногогосударственного бюджетного образовательного учреждения высшегообразования «Саратовский национальный исследовательский государственныйуниверситет имени Н.Г.Чернышевского», г. Саратов.Федосов Иван Владленович,Научныйруководитель: кандидат физико-математических наук, доцент кафедрыоптики и биофотоники ФГБОУ ВО «Саратовскийнациональныйисследовательскийгосударственныйуниверситет имени Н.Г.Чернышевского»Официальныеоппоненты:Беликов Андрей Вячеславович,доктор физико-математических наук, профессор, профессоркафедры лазерной фотоники и оптоэлектроники, ФГАОУ ВО«Санкт-Петербургский национальный исследовательскийуниверситет информационных технологий, механики иоптики»Михаил Алексеевич Ходорковский,кандидат физико-математических наук, руководитель НИК«Нанобиотехнологии», ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургскийполитехнический университет Петра Великого»Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждениенауки «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмовРоссийской академии наук» , 410049, Россия, Саратов, просп.

Энтузиастов, 13Защита состоится « 21 » февраля 2019 г. в 14-00 часов на заседаниидиссертационного совета Д 212.229.25 при Федеральном государственномавтономном образовательном учреждении высшего образования «СанктПетербургский политехнический университет Петра Великого» (ФГАОУ ВО«СПбПУ») по адресу: 194021, г. Санкт-Петербург, ул. Хлопина, д. 11.С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГАОУВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого» поадресу: 195251, г. Санкт-Петербург, Политехническая ул., д. 29, а также насайте ФГАОУ ВО «СПбПУ»: http://www.spbstu.ru.Автореферат разослан «__» ________ 2018 г.Ученый секретарьдиссертационногосовета,доктор биологическихнаук:Линькова НатальяСергеевна2Актуальность работы.

Одной из актуальных задач медицины XXI векаявляется развитие персонализированных методов профилактики, диагностики илечения патологических состояний. Задачи персонализированной медицинынеразрывно связаны с развитием различных полимерных систем доставкибиологически активных веществ. В настоящее время полимерные носителишироко используются в биомедицинских приложениях, таких как адреснаядоставка лекарственных средств, репродуктивная и регенеративная медицина,антибактериальная и противораковая терапия, тканевая инженерия, а такжеприменяются для контроля экспрессии генов клеточных культур. Существуетширокий спектр систем адресной доставки биологически активных веществтаких,каквизикулымикрокапсулы,позволяющиеинкапсулированныемагнитного,гидрогеля,агентыультразвуковогонеполимерныетольколипосомальныеконтролируемопосредствомилиилилазерного,биохимическоговысвобождатьэлектрического,воздействия,ноивизуализировать целевые участки биологических тканей.Применение подобных микроносителей имеет ряд ограничений, связанныхс проблемами контроля их распределения в живых системах.

Применениемагнитныхнаночастицдляфункционализацииоболочкимикрокапсулпозволяет неинвазивно концентрировать магнитные микрокапсулы в целевойобласти биологической ткани in vivo, под действием внешнего неоднородногомагнитногополя.Клеткиспособныинтернализироватьполимерныемикрокапсулы посредством эндоцитоза, что открывает возможность дляконтроляперемещенияклеточныхносителей,функционализированныхмагнитными микрокапсулами, при помощи неоднородного магнитного поля.В контексте задач модификации таких крупных объектов, как клеточныеподложки, поверхности медицинских имплантов и т.д., наиболее подходящиминосителямибиологическиактивныхнаноплёнки.Полимерныетрёхмерныевеществ,являютсяполимерныемикроструктурированныеплёнки(ПТМП) являются новым типом полимерных носителей, которые представляютсобой полимерную наноплёнку c массивом трёхмерных уединённых полых3микроконтейнеров (МК) на её поверхности.

ПТМП могут изготавливаться какметодами последовательной адсорбции, так и методами микролитографии, чтопозволяет варьировать физико-химические свойства стенок микроконтейнеровПТМП. Также ПТМП носители позволяют герметично инкапсулировать какнизкомолекулярные,такивысокомолекулярныеводорастворимыебиологически активные вещества в уединённых МК на поверхности ПТМП. Врезультате достигается возможность равномерно распределять биологическиактивные вещества по поверхности плёнки в виде небольших одинаковыхкластеров, которые возможно активировать как поодиночке, так и целымигруппами посредством лазерного излучения, в том числе, подведённого черезоптическое волокно.Целью работы являлась разработка и апробация методов неинвазивнойадресациибиологическиактивныхвеществиактивацииполимерныхмикроносителей в живых системах.

Для достижения поставленной целинеобходимо было решить следующие задачи:1.Разработка и апробация физических методов визуализации и магнитногозахватаполимерныхмногослойныхфлуоресцентныхмикрокапсул,функционализированных магнитными наночастицами, в разветвлённых сетяхкровеносных сосудов брыжейки крысы. 2. Разработка и апробация методовмагнитного захвата модельных клеток MA-104, поглотивших магнитныефлуоресцентныемногослойныемикрокапсулы,дляформированияжизнеспособной клеточной колонии в стеклянном фантоме кровеносногососуда. 3. Разработка неинвазивных оптических методов визуализациидинамики микропотоков крови в разветвлённой сети сосудов методамиадаптивного корреляционного PIV анализа (Particle Image Velocimetry).4.Разработка метода фототермической лазерной активации полимернойтрёхмерной микроструктурированной плёнки с массивом МК на её внешнейповерхности при помощи оптического многомодового волокна, в фантомемягких тканей на основе агарозного геля.

5. In situ лазерная инфракраснаяактивация клеточной подложки на основе полимерной трёхмерноймикроструктурированной плёнки с массивом МК на её внешней поверхностидлядоксициулин-индуцированнойактивацииэкспрессиизелёногофлуоресцентного белка (Green Fluorescence Protein) у единичных клеток.4Основные положения, выносимые на защиту1. In vivo локализация магнитных многослойных микрокапсул под действиемнеоднородного магнитного поля происходит в зонах изгибов и ветвленийваскулатурной сети.2. Клетки МА-104, поглотившие магнитные капсулы, способны формироватьжизнеспособную клеточную колонию под действием неоднородногомагнитного поля.3.

Использование полимерных трёхмерных микроструктурированных плёнок смассивами полых контейнеров в качестве клеточной подложки позволяетактивировать посредством фототермического лазерного воздействия какединичные микроконтейнеры, для доксициклин-индуцированной активацииэкспресии зелёного флуоресцентного белка единичных клеток, так и группымикроконтейнеров для управляемого высвобождения инкапсулированныхвеществ внутри мягких тканей.4.

Единичныймикроконтейнерполимернойтрёхмерноймикроструктурированной клеточной подложки способен выступать вкачестве носителя доксициклина, высвобождение которого способностимулировать экспрессию зелёного флуоресцентного белка, по меньшеймере, в одной клетке.Научная новизна1. В данной диссертационной работе впервые была реализована методикаадресации флуоресцентных многослойных микрокапсул в потоке крови invivo, в пределах выбранного сосудистого сегмента васкулатурной сети, припомощи электромагнитного пинцета.2.

Впервые была реализована методика магнитного захвата модельных клетокМА-104, поглотившихмагнитные флуоресцентные многослойныемикрокапсулы, в стеклянном фантоме кровеносного сосуда. В результатебыла сформирована жизнеспособная клеточная колония под действиемнеоднородного магнитного поля.3. Разработана оригинальная безмаркерная методика визуализации сосудистыхсетей на основе корреляционных алгоритмов для построения карт скоростейкрови. Разработана методика маскирования границ сосудов на основелокальной бинаризации изображений кровеносных сосудов.4. Разработана новая методика фототермической активации полимернойтрёхмерной микроструктурированной плёнки с массивом МК на её5поверхности при помощи воздействия инфракрасным лазерным излучением,через многомодовое оптическое волокно.

Лазерная фототермическаяактивация микроструктурированной полимерной плёнки производиласьвнутри фантома мягких тканей.5. Впервые была продемонстрирована система для лазерной инфракраснойфототермическойактивацииединичныхМКтрёхмерноймикроструктурированной плёнки с последующим высвобождениеминкапсулированного доксициклина. Разработана методика доксициклининдуцированной активации экспрессии зелёного флуоресцентного белка уединичных клеток на клеточной подложке на основе полимерной трёхмерноймикроструктурированной плёнки с массивом МК на её поверхности.Практическая значимостьПредставленные методы адресации магнитных полимерных микрокапсулпри помощи магнитного пинцета могут применяться в рамках задач магнитнойсепарации клеток, адресной доставки опухолевых супрессоров к целевымбиологическим тканям, а также для клеточной терапии и регенеративноймедицины.Полимерныемикроструктурированныеплёнкимогутиспользоваться для модификации поверхности медицинских имплантов(антибактериальная терапия), в качестве биологических сенсоров в пищевойпромышленности,длямикробиологическихисследований,клеточнойинженерии и в качестве нейрональных имплантов.ДиссертационнаяработавыполняласьприподдержкегрантовПравительства Российской Федерации №14.Z50.31.0004, РНФ №16-15-10252, атакже в рамках проектной части госзадания в сфере научной деятельности№3.1586.2017/ПЧ.Степеньдостоверностиполученныхрезультатовобеспечиваетсяприменением современных методов исследования, таких как оптическаяфлуоресцентнаямикроскопия, оптическая конфокальная флуоресцентнаямикроскопия, сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), трансмиссионнаяэлектронная микроскопия (ТЭМ).