Автореферат (Фитохимическое исследование клубней топинамбура и создание лечебно - профилактических средств на его основе), страница 3

3. Хроматограмма ВЖЭХРис. 4. Хроматограмма ВЭЖХсмеси стандартов, содержащая,извлечения из клубней топинамбураанализируемые углеводы вконцентрации 10 г/л.Как показывают результаты исследования рис. 3,4, в клубнях топинамбурасвободные сахара представлены фруктозой, глюкозой и сахарозой11glucose-PMP3001602001008000552401608010Retention Time15( min)1510Retention Time (min)NametR(min)Peak AreaArea Percentd-mannose-PMP4.898.426e+6tR(min)Peak AreaAreaPercent 17.4glucosamine-PMP6.515.332e+611.06.522.807e+632.28.607.507e+615.58.56 glucose-PMP1.654e+619.09.319.891e+620.49.28 d-xylose-PMP1.924e+52.2d-galactose-PMP9.956.685e+613.89.899.275e+41.1d-arabinose-PMP10.428.621e+617.810.525.588e+40.62020Рис. 5.

Хроматограмма ВЖЭХ,смеси стандартов анализируемыхglucosamine-PMPуглеводов с концентрацией 1 г/л.dad1A.chglucosamine-PMP320d-xylose-PMPd-galactose-PMPd-arabinose-PMP400240400Результатыglucose-PMPd-xylose-PMPd-galactose-PMPd-arabinose-PMP500480эксперимента0510Retention Time (min)1520Рис. 6. Хроматограмма ВЖЭХ,гидролизата извлечения из клубнейтопинамбураNamed-mannose-PMPglucosamine-PMPglucose-PMPd-xylose-PMPd-galactose-PMPd-arabinose-PMPtR(min)4.886.518.569.269.8810.48dad1A.chсвидетельствуют,чтоPeak AreaArea Percent8.478e+40.83.288e+631.98.532e+58.38.211e+58.01.892e+51.85.810e+40.6glucosamine-PMP600560d-mannose-PMP320700Response800400dad1A.chglucose-PMPd-xylose-PMPd-galactose-PMPd-arabinose-PMPd-mannose-PMPglucosamine-PMPdad1A.ch900480Nameglucosamine-PMPglucose-PMPd-xylose-PMPd-galactose-PMPd-arabinose-PMPсвязанныесахара560320240160800Named-mannose-PMPlucosamine-PMPglucose-PMPd-xylose-PMPd-galactose-PMPd-arabinose-PMP5400320240Таблица 1Результаты определения содержания свободных и связанных сахаров16080в клубнях топинамбура методом ВЖЭХ (n=5)10Retention Time (min)Номеробразца1.2.3.Номеробразца1.2.3.tR(min)4.906.528.569.279.8810.48480d-mannose-PMPglucose-PMPd-xylose-PMPd-galactose-PMPd-arabinose-PMP400glucose-PMPd-xylose-PMPd-galactose-PMPd-arabinose-PMPResponseпредставлены маннозой, глюкозой, ксилозой, галактозой и арабинозой.480d-mannose-PMPResponseglucosamine-PMPэлектрофорезом после кислотного гидролиза.

Результаты на рис. 5,6 и табл.1.dad1A.chResponseResponseОпределение связанных сахаров проводили методом ВЭЖХ и капиллярным15200510Retention Time (min)Содержание свободных сахаров, %ФруктозаГлюкоза0,51±0,0100,52±0,0100,55±0,0110,57±0,0110,49±0,0090,48±0,002Содержание связанных сахаров, %Манноза ГлюкозаКсилоза Галактоза0,007±0,00021 3,01±0,060,46±0,090,44±0,080,003±0,00012 3,13±0,060,51±0,100,47±0,090,005±0,00020 2,98±0,580,43±0,080,43±0,08Peak AreaArea Percent2.444e+40.33.075e+636.51.291e+615.31.966e+52.31.262e+51.55.771e+40.7Named-mannose-PMPglucosamine-PMPglucose-PMPd-xylose-PMPd-galactose-PMPd-arabinose-PMPtR(min)4.876.518.559.259.8810.4715Peak AreaArea Percent4.991e+40.53.243e+634.79.697e+510.48.028e+58.61.821e+52.03.707e+40.4Сахароза3,22±0,063,51±0,072,99±0,05Арабиноза0,15±0,0030,19±0,0030,13±0,002Из табл.

1 видно, что в клубнях топинамбура содержатся свободные сахарав следующих концентрациях: фруктоза от 0.49 до 0,55%, глюкоза от 0,48 до0,57% и сахароза от 2,99 до 3,51%. Как показывают результаты табл. 1, вклубнях топинамбура найдены 5 связанных сахаров:манноза (от 0,003 до 0,007%), глюкоза (2,98-3,13%), ксилоза (0,43-0,51%),галактоза (0,43-0,47%), и арабиноза (0,13-0,19)%Определение аскорбиновой кислоты методом ВЭЖХОбразцы топинамбура изучены на содержание аскорбиновый кислотыПолученные результаты представлены в табл.

2.1220Таблица 2Результаты количественное определение аскорбиновой кислотыв клубнях топинамбураПлощадь Содержание аскорбиновой кислоты, мг/ %№ партиипика18131319,6±0,3910869426,2±0,50231099385265±5,30Из табл. 2. следует, что содержание аскорбиновой кислоты в клубняхтопинамбура находится в пределах от 19,6 до 265 мг/%.Определение дубильных веществ проводили перманганатометрическимметодом, результаты которого приведены в таблице 3.Таблица 3Результаты количественного определения дубильных веществклубнях топинамбура (n=5)№ образца1234Содержание дубильных веществ, %0,34±0,0060,81±0,0160,62±0,0120,52±0,010Результаты анализа данных, представленных в табл. 3, свидетельствуют, чтосодержание дубильных веществ в клубнях колеблется в пределах от 0,34 до 0,81 %.Качественное определение полисахаридовТонкослойная хроматограма при определении инулина и фруктозы в клубняхтопинамбура приведена в системе растворителей изопропанол – вода (4:1).Извлечение из сырья топинамбура дает зоны адсорбции красно – оранжевогоцвета с Rf 0,62, соответствующий инулину и Rf 0,68, соответствующий фруктозе.Количественное определение полисахаридов методом спектрофотометрияВалидация методики проведена по параметрам линейности, повторяемостивоспроизводимости и правильности методики.Определение линейности проводили на 5 уровнях концентраций.

Былприготовлен исходный раствор СО инулин (Sigma 12255) с концентрацией 0,1%.Затем из него готовили разбавленные растворы, для этого в мерные колбывместимостью 25 мл помещали 0,5; 1,5; 2,5; 3,5; 4,5 мл полученного раствора,прибавляли 5мл 0,1% спиртового раствора резорцина и по 10 мл 30% растворакислоты хлористоводородной, нагревали до 80 0С в течение 20 мин.13Охлаждали до комнатной температуры, доводили объем раствора в колбах30% раствором кислоты хлористоводородной до метки и измеряли оптическуюплотность спектрофотометра при длине волны 483 нм относительно растворасравнения.рис.7.1D0,80,60,40,200,0010,0030,0050,0070,009C,%Рис.

7. Зависимость оптической плотности раствора от концентрации инулина.По полученным экспериментальным данным рассчитывали коэффициенткорреляции, который должен быть не ниже 0,99. В нашем случае коэффициенткорреляции составил 0,998 (рис 7., табл. 4).Таблица 4Результаты статистической обработки данныхfχγbar40,00501,8905378,70,00300,998Повторяемость методики определяли на том же образце сырья в 5повторностях (табл.5). Критерий приемлемости выражался величинойотносительного стандартного отклонения, которое не должно превышать 10 %.Он составил 1,83%, что свидетельствует о прецизионности методики вусловиях повторяемости.

табл. 6.Таблица 5Определение повторяемости разработанной методики№ п/п12345Содержание суммы полисахаридов,%15,9515,9516,3015,7015,9014Таблица 6Метрологические характеристики методики количественного определениясуммы полисахаридов (фруктозанов и фруктозидов) в клубнях топинамбураfX¯, гs2sРt(P, f)∆х415,960,0050,234952,780,292ε1,83Правильность методики устанавливали путем измерения количественногосодержания суммы полисахаридов в перерасчете на инулин в растворах,полученныхпутемдобавлениянеобходимогоколичествастандартноговещества к исследуемому раствору. Критерий приемлемости -средний процентвосстановленияприскорректированныйиспользованиина2,78%.растворовВзаданныхразработаннойконцентраций,методикепроцентвосстановления находился в пределах от -1,70% до +1,73%. (табл.7).Таблица 7Результаты количественного определения суммы полисахаридов в клубняхтопинамбура с использованием способа добавок инулина (n=5)НайденаВведеноДолжна бытьНайденая Относитесумма суммыинулинанайдена суммысуммыльнаяполисахаридов,г/100 гполисахаридов,полисахаридов, ошибка,г/100 г сырьясырьяг/100 г сырьяг/100 г сырья%17,5513,1638,7138,07- 1,6517,728,8626,5827,04+ 1,7323,585,9029,4828,98- 1,70Ошибка единичного определения при доверительной вероятностью 0,95 непревышает ±1,83%, систематическая ошибка отсутствует.Валидируемая методика может быть признана правильной, посколькуопределяемые экспериментально значения лежат внутри доверительныхинтервалов, соответствующих средним результатам анализа.

Рассчитанныезначения tвыч.оказались меньше табличного (t табл = 2,78 при Р = 95 %, f = 4),что позволяет с вероятностью 95 % сделать вывод об отсутствии значимойсистематической ошибки.Обоснованность методики подтверждена результатами определения такихвалидационныххарактеристиккаквоспроизводимости и правильности.15линейности,повторяемостиС помощью разработанной методики проанализированы 6 партии клубнейтопинамбура.

Полученные результаты представлены в табл. 8.Спектры, полученные при определении фруктозанов и фруктозидовпредставлены на рис.8.Рис. 8. Спектры поглощения продуктов реакции раствора инулина иводного извлечения из клубней топинамбура с резорцином в кислой среде1 – 0,004% раствор инулина 2 – водного извлечения из клубней топинамбураТаблица 8Определение содержания суммы полисахаридов (фруктазанов ифруктозидов) в клубнях топинамбура (n=5)Партия123456Содержание фруктазанов и фруктозидов, %17,72±0,3523,58±0,4720,15±0,4013,83±0,3515,85±0,3824,17±0,29На основании полученных данных установлено нормативное содержаниесуммы полисахаридов в клубнях топинамбура на уровне – не менее 10 %.Идентификация сапонинов в клубнях топинамбураИспользован метод ТСХ, в качестве стандартный раствор использованэсцин и испытуемый раствор извлечения из клубней топинамбура приведена всистеме растворителей н – бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (5:1:4).На хроматограмме испытуемого раствора обнаружены 4 зона адсорбции сRs = 1,28; Rs = 1,11; Rs = 0,98; Rs = 1,0 относительно зоны адсорбции эсцина.16Получение настойки гомеопатической матричной из свежих клубнейтопинамбураКлубни топинамбура входят в перечень гомеопатических лекарственныхсредств, разрешенных к применению в России в соответствии с приложением кприказу МЗ РФ № 335 от 29.11.95 г.