Диссертация (Микробиологическая характеристика, механизмы устойчивости к антибиотикам и молекулярная эпидемиология резистентных форм респираторных патогенов и госпитальных грамотрицательных бактерий)

Федеральное государственное автономное учреждение«Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей»Министерства здравоохранения Российской ФедерацииНа правах рукописиЛазарева Анна ВалерьевнаМикробиологическая характеристика, механизмы устойчивостик антибиотикам и молекулярная эпидемиология резистентных формреспираторных патогенов и госпитальных грамотрицательных бактерий03.02.03 – МикробиологияДиссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наукНаучный консультант:профессор РАН,доктор медицинских наукМаянский Н.А.Москва 20182ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………..5ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ……………………………………………………...22Глава 1. Обзор литературы……………………………………………….221.1.Возбудители инфекций, связанных с оказанием медицинскойпомощи………………………………………………………………...221.1.1. Acinetobacter baumannii…………………………………………….241.1.2.

Klebsiella pneumoniae……………………………………………….291.1.3. Pseudomonas aeruginosa……………………………………………331.2. Возбудители респираторных инфекций…………………………….461.2.1.Streptococcus pneumoniae…………………………………………...461.2.2. Sterptococcus pyogenes……………………………………………...55Глава 2. Материалы и методы исследования……………………………572.1. Выделение, идентификация и анализ госпитальныхбактерий………………………………………………………………..572.1.1.

Определение чувствительности к антибиотикам………………...582.1.2. Молекулярно-генетические методы исследования………………602.1.3. Исследование биопленкообразования у штаммов A. baumannii...652.2. Выделение, идентификация и анализ респираторных патогенов…66Глава 3. Госпитальные грамотрицательные бактерии………………….713.1.

Динамика микробиоты, колонизирующей слизистые оболочки вовремя пребывания в ОРИТ, при анализе трахеального аспирата……...713.2. Результаты микробиологического исследования крови…………...783.3. Результаты микробиологического исследования ликвора ………..83Глава 4. Клональное разнообразие, молекулярные механизмыустойчивости к карбапенемам и биопленкообразование укарбапенемрезистентных штаммов A. baumannii,выделенных в г. Москве………………………………………….8734.1. Распределение клональных комплексов и сиквенс-типов согласносхемам Oxford и Pasteur…………………………………………….874.2. Определение чувствительности к антибиотикам и идентификациягенов β-лактамаз…………………….………………………………..924.3. Образование биопленок……………………………………………...93Глава 5.

Клональное разнообразие, молекулярные механизмыустойчивости к карбапенемам у карбапенемрезистентныхштаммов K. pneumoniaе…………………………………………975.1. Профиль чувствительности к антибиотикам изолятовK. pneumoniaе……………………………………………………….975.2. Молекулярные механизмы устойчивости изолятов K. pneumoniaeк β-лактамным антибиотикам……………………………………….5.3. Клональная структура популяции K. pneumoniae………..…………99100Глава 6. Популяционная структура карбапенемрезистентныхштаммов P.

aeruginosa и носительство металло-β-лактамаз……1056.1. Характеристика популяционной структуры карба-Р P. aeruginosa.1066.2. Носительство МБЛ-карбапенемаз…………………………………...109Глава 7. Респираторные патогены………………………………………..1117.1. Динамика распространенности серотипов иантибиотикорезистентности носоглоточных пневмококков, ввыделенных в 2010-2016 гг…………………………………………1117.2. Динамика резистентности и клональная эволюция пневмококковсеротипа 14 в 2010-2015 гг. ……………………………………….1277.3. Клональная эволюция пневмококков серотипа 19Ав 2002-2013 гг. …...…………………………………………………..1367.4.

Распространенность и механизмы устойчивости к макролидамS. pyogenes……………………….………………………………….152ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………158ВЫВОДЫ………………………………………………………………….1794ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ………………………………….181ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ…………….182СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.………………………………………………183СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.………………………………………………..1855ВВЕДЕНИЕАктуальность темы диссертационного исследованияПроблемы возникновения, распространения и эволюции резистентностимикробовкантибиотикамнаходятсявцентревниманияклиническоймикробиологии. Антибиотикорезистентность расценивают как одну из значимыхугроз для человечества в XXI веке [276, 191]. Это связано с тем, что на фонезамедленияразработкиновыхантимикробныхпрепаратовнаблюдаетсяповсеместный рост резистентности к ним и появление панрезистентных штаммовмикробов [265, 162]. Серьезность сложившейся ситуации побудила Всемирнуюорганизациюздравоохранения(ВОЗ)составитьпереченьантибиотикорезистентных возбудителей, распространение которых вызываетнаибольшую угрозу [384].

В этот список, опубликованный в феврале 2017 г.,вошли 12 видов бактерий, в том числе устойчивые к карбапенемам представителисемейства Enterobacteriaceae, карбапенемрезистентные Acinetobacter spp. иPseudomonas spp., а также нечувствительные к пенициллину Streptococcuspneumoniae. Указанная инициатива ВОЗ имела целью привлечь внимание всехзаинтересованныхсторон,включаяисследовательскиеорганизации,фармацевтические компании и правительственные структуры, к решениюпроблемынарастающейрезистентностимикробовкантибиотикам,стимулировать разработку новых антибиотиков и развитие национальныхпрограмм по борьбе с антибиотикорезистентностью.Российские данные свидетельствуют о том, что приведенный ВОЗ списокпатогенов актуален и для нашей страны. В этиологической структуре инфекций,связанныхсоказаниеммедицинскойпомощи(ИСМП),ведущаярольпринадлежит грамотрицательным условно-патогенным бактериям, включаяEnterobacteriaceae (в том числе Klebsiella pneumoniae), Acinetobacter baumannii,Pseudomonas aeruginosa и ряд других [81, 82, 90, 96].

Госпитальные штаммыуказанныхмикроорганизмов,какправило,обладаютмножественнойлекарственной устойчивостью (МЛУ). Так, по данным многоцентрового6исследования об устойчивости грамотрицательных патогенов МАРАФОН (20132014гг.),МЛУ-фенотипомобладали82,2%госпитальныхизолятовEnterobacteriaceae, 64,4% – A. baumannii и 51,4% – P. aeruginosa [81, 82, 90].Особую обеспокоенность вызывает неуклонно возрастающая устойчивостьграмотрицательных бактерий к антибиотикам из группы карбапенемов. В течениедлительноговременикарбапенемысчиталисьантибиотикамирезерва,ибольшинство патогенов сохраняли к ним чувствительность [65, 163].

Однако впоследние годы их эффективность начала снижаться из-за распространенияустойчивых штаммов, нередко обладающих целым набором детерминантрезистентности. Одним из движущих факторов нарастания резистентности сталоувеличение объема потребления карбапенемов, в первую очередь в отделенияхреанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) [3, 4]. Главным механизмомрезистентности к β-лактамам в целом и к карбапенемам в частности являетсяпродукция ферментов, гидролизующих антибиотики, таких как β-лактамазырасширенного спектра (БЛРС) и карбапенемазы [297]. Важную роль вформированиирезистентностимогутиграть:эффлюксантибиотикаизбактериальной клетки, модификация мишени, а также нарушение проницаемостиза счет изменения структуры пориновых каналов [3, 75, 123, 254].В распространении устойчивости к карбапенемам важную роль играютнеферментирующие глюкозу грамотрицательные бактерии (НГОБ) A.

baumannii иP. aeruginosa. Как было указано выше, наряду с представителями семействаEnterobacteriaceae они приобрели заметный вес в структуре ИСМП. Природнаяустойчивость данных микроорганизмов ко многим классам антибиотиковобъясняеттрудностилеченияинфекций,ассоциированныхсними,иобусловливает необходимость использования карбапенемов и их комбинаций сдругими антибиотиками широкого спектра действия. Обладая пластичнымгеномом, A. baumannii и P. aeruginosa способны приобретать и интегрироватьновые детерминанты резистентности, в частности, карбапенемазы, приобретаяМЛУ-фенотипистановясьвекторамидиссеминацииустойчивостиккарбапенемам не только на уровне вида, но и между видами [306]. Это объясняет7пристальное внимание к представителям Acinetobacter spp.

и Pseudomonas spp. какмикробиологов, так и специалистов в области эпидемиологии.В педиатрической практике недостаточно изучена структура микробиотыдетей в ОРИТ, ее чувствительность к антибиотикам, распространенность имеханизмы резистентности [218, 228, 254, 303]. По данным S.C. Kehl, DowzickyM.J., среди грамотрицательных патогенов, выделенных у детей с 2004 по 2012годы, большинство бактерий семейства Enterobacteriaceae показали высокуючувствительность (>95%) к амикацину, тигециклину и карбапенемам (имипенем имеропенем).

A. baumannii в 90% случаях проявлял чувствительность кминоциклину. Амикацин был наиболее активным против P. aeruginosa (90%).Штаммы K. pneumoniae, продуцирующие БЛРС, составили 24%. Статистическизначимые различия в уровнях чувствительности отмечались между возрастнымигруппами (1-5 лет, 6-12 лет или 13-17 лет). Значительные различия былизарегистрированы для всех патогенов при сравнении чувствительности в детскойи взрослой популяциях.

Так, амикацин, тигециклин и карбапенемы были активныin vitro против большинства грамположительных патогенов, выделенных у детей,а A. baumannii и P. aeruginosa были восприимчивы к меньшему количествупротивомикробных препаратов [228]. Следует отметить, что спектр применяемыхантимикробных препаратов в педиатрической практике имеет возрастныеограничения. Так, препаратами выбора при лечении инфекций, вызванныхустойчивыми к карбапенемам бактериями, являются колистин, полимиксин В,фосфомицин, тигециклин, которые разрешены у детей только старшего возраста[4, 228].Развитие и совершенствование молекулярно-генетических технологийвнесло существенный вклад в формирование базы знаний, касающихсямеханизмов устойчивости к антибиотикам, их эволюции и распространения.Применение секвенирования нуклеотидных последовательностей консервативныхучастков нескольких генов «домашнего хозяйства» (метод получил названиемультилокусноесиквенс-типирование–МЛСТ)позволяетоцениватьгенетическую структуру бактериальной популяции.

Базы данных МЛСТ,8содержащие сведения о генотипах (сиквенс-типах – ST) бактерий, даютвозможность выявлять местные особенности в контексте мировой информации[93, 233, 278, 310]. С появлением МЛСТ стало очевидно, что многие видыбактерий имеют клональную структуру, а некоторые клоны распространеныповсеместно [383]. Наибольшую опасность представляют международные клонывысокого эпидемического риска, обладающие МЛУ, которые способны быстрораспространяться. В связи с этим мониторинг молекулярной эпидемиологииприоритетных патогенов является важным инструментом для контроля зараспространениемантибиотикорезистентностииразработкимерпоеепрофилактике.Респираторные инфекции занимают ведущее место в структуре детскойзаболеваемости и являются наиболее частой причиной обращения за медицинскойпомощью, а также назначения антибиотиков [12].