Автореферат (Сравнительная иммуноморфологическая и спектроскопическая характеристика опухолей почек), страница 2

Срезы толщиной 5-7мкм, окрашенные гематоксилином и эозином и пикрофуксином по ван Гизону, подвергалиобзорному морфологическому анализу, при котором определяли гистологический тип опухоли,степень дифференцировки, выраженность вторичных изменений ираспространенностьопухолевого процесса. Для определения гистологического варианта почечно-клеточного рака(ПКР) использоваликлассификацию ВОЗ(2004 г), согласно которой, в подавляющембольшинстве случаев, был выявлен его светлоклеточный вариант -67 (79 %) случаев,папиллярный – 10 (12 %) и хромофобный – 8 (9 %) наблюдений.

Степень дифференцировкиопухолевых клеток определяли согласно общепринятой шкале градаций по Фурману (1982)(Табл. 2).В ходе исследования проводили гистохимические реакции, позволяющие оценить наналичие и распространенность склеротических изменений, выраженность экстрацеллюлярногоматрикса с помощью трихрома по Массону.Иммуногистохимическоеисследованиепроводилинапарафиновыхсрезахсиспользованием стрептавидин-биотинового метода с применением двухшаговой полимернойсистемывизуализации«EnVision+DualLinkSystem-HRP» DakoCytomationспомощьюмоноклональных антител к СК-7, Vimentin, CD10, позволяющих подтвердить или опровергнутьтот или иной вариант ПКР. Каждое иммуногистохимическое исследование предусматривалопроведениепроцедурыположительногоиотрицательногоконтролядляисключениявероятности получения ложнонегативных и ложнопозитивных результатов.

Отрицательныйконтроль исключал неспецифическое окрашивание. На контрольный срез наносили фосфатносолевой буфер без первичного антитела. Положительный контроль подтверждал поставленнуюиммуногистохимическуюреакциюсданнымантителом.Порезультатамииммунногистохимического исследования оценивали интенсивность экспрессии: менее 5%клеток— отрицательная (-), 5-24% - слабоположигельная (+) , 25-74% — умеренноположительная (++) , более 75%—выраженная (+++).8Раман-флуоресцентное исследование проводили с помощью программно-аппаратногокомплекса – анализатора, состоящего из микроскопа Olympus и спектрометра ИнСпектр R532,разработанного ООО «ИнСпектр» (РУ №РЗН 2015/2419 от 18.05.2015).

Длина волны лазерногоизучения (532 нм), размер лазерного пятна в фокусе (10 мкм в диаметре) и мощность лазера (10мВт) были стандартными, и их постоянство и стабильность обеспечивались техническимихарактеристиками программно-аппаратного комплекса. Управление прибором, регистрацию изапись спектров производили с помощью специальной компьютерной программы ИнСпектр,также разработанной сотрудникамиООО«ИнСпектр» (г. Черноголовка). Программаосуществляла идентификацию химических веществ, соединений и отдельных молекул ирегистрировала изменения их количественного и качественного состава при различныхсостояниях, а в нашей работе – в изучаемых группах.Полученные данные, будучи по своей сути многомерными и многопараметровыми (длинаволны рассеянного излучения, интенсивность флуоресценции и рамановского рассеяния)анализировали с использованием метода дискриминантного анализа с помощью проекции налатентные структуры (PLS-DA).

Все методы предобработки и многомерный анализ былиреализованы в онлайн программном обеспечении ТРтcloudbeta.Статистическую обработку данных выполняли на персональном компьютере с помощьюэлектронных таблиц Microsoft Excel и пакета прикладных программ Statistica for Windows 7,0(Stat.Softinc.США).Всеполученныеколичественные,анамнестические,клинические,лабораторные и инструментальные данные обрабатывали методом вариационной статистики.Для оценки взаимосвязи нескольких признаков проводили корреляционный анализ поСпирмену и/или Пирсону. Различия считались статистически достоверными при значении рменее 0,05.Результаты исследования и их обсуждениеРезультаты иммуноморфологического и спектроскопического исследований образцовсветлоклеточного почечно-клеточного ракаНа светооптическом уровне при исследовании образца, полученного из центральнойчасти опухолевого узла, опухоль состояла из полиморфных полигональных, либо округлоовальных клеток со светлой оптически пустой цитоплазмой, образующих альвеолярные илидольковые структуры, разделенные тонкопетлистой сетью соединительной ткани.

Клеткисущественным образом отличались друг от друга размером и формой ядер, наличием или9отсутствием ядрышек, идентифицируемой или неидентифицируемой структурой хроматина, атакже его расположением: очаговым, диффузным или маргинальным (Рис. 1Б).Раман-флуоресцентныеспектрыобразцовсветлоклеточногорака,полученныенепосредственно из центра опухолевого узла имели характерные особенности в виде набораспецифических своеобразных «пиков» в диапазоне от 1000 до 2980 см-1, которые отличалисьдруг от друга положением и интенсивностью в зависимости от степени дифференцировкиопухоли.

Пик 1003см-1 соответствовал рассеянию молекул фенилаланина, 1157см-1–метионина,1517см-1и 2965см-1 различным модификациям бета-каротина (данное сочетание рамановскихпиков отмечено в 100% случаев), а 2977см-1 молекулам холестерина (в 16,6% случаев).Локальный максимум флуоресценции соответствовал значению 2497+33,02 см-1 и былобусловлен флуоресценцией эндогенных порфиринов (Рис.

1А), интенсивный синтез которыхможно рассматривать как некую «аварийную» ответную реакцию всего организма наразвивающийсяприопухолевомростеанаэробныйгликолиз.Патогистологическаяхарактеристика образца, полученного из участка, расположенного на периферии опухолевогоузла, в целом, содержала набор признаков, свойственных центроузловым образцам, однакозначительная часть клеток была лишена ядер, а сами клеточные элементы опухолирасполагались более упорядочено. По своим спектральным характеристикам периферическиеучастки по существу не отличались от центроузловых, но имели сравнительно низкуюинтенсивность рамановского рассеяния света, что на соответствующих спектрах проявлялосьменьшей высотой регистрируемых пиков.

Вместе с тем, и значения частот, и наборрассеиваемыхмолекул, был идентичен, однако локальный максимум флуоресценцииэндогенных порфиринов был несколько снижен (Рис.1В).Рисунок 2. Результаты иммуногистохимического исследования образца светлоклеточногоПКР. А. Выраженная экспрессия виментина опухолевыми клетками. Х100. Б. Отсутствиеэкспрессии СК-7 опухолевыми клетками. Х200. В. Положительная экспрессия CD10опухолевыми клетками.

Х40010Рисунок 4. Результаты иммуногистохимического исследования образцов папиллярногоПКР. А. Выраженная экспрессия СК-7 опухолевыми клетками. Х100. Б. Выраженнаяэкспрессия виментина опухолевыми клетками. Х200. В. Выраженная экспрессия CD10опухолевыми клетками. Х100.Рисунок 7. Результаты иммуногистохимического исследования образца хромофобногоПКР.А. Отсутствие экспрессии СК-7 опухолевыми клетками.

Х200. Б. Отсутствие экспрессиивиментина опухолевыми клетками. Х400. В. Выраженная экспрессия СК-7 опухолевымиклетками. Х200.1112В зависимости от наличия и вариабельности вышеперечисленных признаков все случаисветлоклеточного ПКР были распределены согласно общепринятой шкале градацийS.A.Fuhrman на четыре степени (G1 – 19 (23,3%), G2 – 33 (49,2%), G3 – 10 (14,92%), G4 – 5(7,46%)) и гистологические характеристики сопоставлены с результатами, полученным в ходераман-флуоресцентной спектроскопии. Наибольшая интенсивность пиков рамановскогорассеяния отмечена у образцов светлоклеточного рака с высокой степенью дифференцировки,что соответствовало степени G1 согласно шкале градаций Фурмана. Кроме того, рамановскиепики 582 см-1, 2977 см-1 (холестерин) вообще не встречался в спектрах образцовсветлоклеточного рака со степенью дифференцировки G2-4 (p<0.05).

Соотношения степенидифференцировки опухоли и интенсивности рамановского рассеяния пиков молекулфенилаланина, в-каротина и холестерина отражены в диаграмме 1. В образцахумереннодифференцированого (G2), низкодифференцированного (G3) инедифференцированного (G4) светлоклеточного ПКР значения интенсивности рамановскогорассеяния имели стойкую тенденцию к снижению по всем показаниям по мере уменьшенияинтенсивность,отн.ед.дифференцировки опухоли и достигали минимума к G4 степени (p<0,001).р<0,0525002000150010005000Фенилаланин (1003 см-1)Метионин (1157 см-1)В-каротин (1517 см-1)G1G2G3B-каротин (2965 см-1)G4Диаграмма 1.Уровень интенсивности рамановских пиков в зависимости от степенидифференцировки светлоклеточного ПКРРезультатыгистологическогоисследованияподтвердилиспомощьюиммуногистохимического анализа с использованием антител к виментину, цитокератину (CK-7)и CD 10.

Во всех случаях светлоклеточного рака наблюдали выраженную положительнуюэкспрессию виментина и CD 10 и отсутствие реакции с СК-7 (p<0,05) (Рис. 2).Кроме того, учитывая значительную частоту возникновения вторичных изменений присветлоклеточном раке, были изучены раман-флуоресцентные спектры, соответствующиеучасткам некроза, кровоизлияний, а также полям склероза. В первом случае для спектраоказалась типичной некоторая «нечеткость», «размытость» его линии, по-видимому, связаннаяс деструкцией ткани опухоли, поэтому и начальная интенсивность характеризовалась довольнонизкими значениями.

Умеренные показатели оказались характерными и для локальных13максимумов флуоресценции (Рис. 3). В случае попадания лазерного луча на участок более илименее выраженной стромы опухоли или поле склероза в интерстиции или паренхиме почкиспектр имел характернуюодногорбую конфигурацию и характеризовался высокимипоказателями интенсивности как начальной флуоресценции, так и её локального максимума засчет суммарной флуоресценции липопигментов и флавинов. Фокусу кровоизлияния вопухолевом узле была свойственна неправильная трех- четырехгорбая или причудливаябесформенная линия раман-флуоресцентного спектра.

Локальным максимумам суммарнойфлуоресценции соответствовали нетипично высокие значения интенсивности флуоресценции, аих положение, как правило, было искаженным (Рис.2.)АБВРисунок 3. Спектральная и морфологическая картина вторичных изменений и участковсклероза образца светлоклеточного ПКР. А. и В.- Ок. гем. и эоз. х200. Б. – Ок. Пикрофуксинпо ван Гизону, х200.При исследовании участков ткани почек, находящихся на максимальном удалении отопухолевого узла и визуально интактных, на светооптическом уровне наблюдали изменения,касающиеся преимущественно канальцевых структур нефронов(вакуольная дистрофия,атрофические и некробиотические изменения).