Автореферат (Диагностика неонатальных пневмоний - клинико-микробиологические и иммунологические аспекты), страница 7

Таким образом, аллель А (определяемая у родильниц)является маркером ВУП. Частоты генотипов исследуемого маркера у родильниц в группеВУП, РНП и группе сравнения были следующими: GG - 0,78, 0,58, 0,58; AA – 0, 0,25, 0; AG 0,22, 0,17, 0,42, соответственно. У новорожденных доминировал аллель G и генотип GG(частота составляла более 0,58). Было выявлено, что риск развития внутриутробного31инфицирования плода ассоциирован с генотипом АА у родильниц, а генотип AG – является«протективным».У новорожденных также проводили исследование ассоциации маркера G(-20)A генаDEFB1 с риском развития ВУП и РНП. Среди аллелей доминировал аллель G (частота былавыше 0,73 во всех группах) и генотип GG (частота превышала 0,52).

Такая же тенденциябыла определена и у родильниц. Однако ассоциаций аллелей и генотипов маркера G(-20)A уноворожденных с патологией не было выявлено. Полученные результаты указывают на то,что генетический маркер G(-20)A гена DEFB1 ассоциирован с риском развития ВУП уноворожденного. Полученные результаты указывают на то, что генетический маркер G(-20)Aгена DEFB1 ассоциирован с риском развития ВУП у новорожденного. Это может бытьсвязано с низкими показателями экспрессии этого гена и со сниженной защитой организмародильницы и как следствие инфицирование плода.На следующем этапе была проведена оценка ассоциации полиморфных маркеров вгенах цитокинов с НП.

В данном исследовании было выбрано три цитокина: IL-10, IL-17 иTNFa. Известно, что все эти цитокины могут вырабатываться в ответ на активацию TLRs. IL17 и TNFα относятся к провоспалительным цитокинам. Помимо провоспалительныхцитокинов в работе также был исследован противоспалительный цитокин - IL-10. Известно,чтоснижениеэкспрессииданногоцитокинаможетприводитькактивациипровоспалительных механизмов и вероятно к разрушению ткани, а увеличение – к супрессиимукозального иммунитета.На первом этапе нами был проведен сравнительный анализ распределения аллелей игенотипов полиморфных маркеров TNFα (-308 G/A) и IL17A (-197 G/A), которыелокализованы в промотерных областях генов.

Часто изменения последовательности ДНК впромотерной области гена связано с изменением экспрессии белка (табл. 5).Во всех группах доминировал аллель А и гетерозиготный генотип. При этомдостоверных различий между частотами аллелей и генотипов в группах с пневмониейноворожденных, внутриутробным инфицированием и группой сравнения в материале отродильницвыявленонебыло.Инаятенденциянаблюдаласьнепосредственноуноворожденных. Аллели в материале от новорожденных во всех группах распределилисьприблизительно одинаково.

В группе новорожденных с пневмонией определяли достоверноеувеличение частоты генотипа GG, которая составляла 0,18 относительно 0,04 – в группесравнения. Таким образом, маркер GG TNFα (-308 G/A) ассоциирован с риском развитияпневмонии у новорожденных и может быть использован в клинической практике. Вероятно,наличие данной замены в геноме новорожденных может быть связано с нарушением балансавыработки TNFα и нарушением защиты.32Таблица 5Распределение аллелей и генотипов маркеров TNFα -308 G>А и IL17A -197 G>A уродильниц и новорожденных в группах с ВУП, с РНП и в группе сравненияРодильницыгруппа сравн.

1ВУПРНПA0,620,580,50новорожденныегруппа сравн. 1ВУПРНПA0,490,500,52Родильницыгруппа сравн. 1ВУПВАПA0,260,310,34новорожденныегруппа сравн. 1ВУПВАППримечание - «*» –TNFα -308 G>A (rs1800629)GрGA0,380,770,42≥0,050,850,50≥0,050,84GрGA0,510,900,50≥0,051,000,48≥0,050,68IL17A -197 G>A (rs2275913)GрGA0,740,430,69≥0,050,61*0,66≥0,050,34A0,660,710,72показательGG000,08AA0,230,150,08р≥0,05≥0,05GG0,040,000,18*AA0,060,000,14р≥0,05<0,05GG0,520,39*0,63AA0,0500,03р≥0,05GрGAGGAAр0,340,310,500,190,29≥0,050,420,500,08≥0,050,28≥0,050,440,500,06≥0,05достоверно отличается от такового в группе сравнения 1(здоровые новорожденные без инфекции) (p  0,05). Для расчета использовали критерий χ2, атакже критерий Фишера.Другой провоспалительный цитокин, который был исследован в работе - IL17.Вклиническом материале от родильниц распределение частот аллелей среди исследуемыхгрупп было следующее: аллель А – 0,26; 0,31 и 0,34, аллель G – 0,74; 0,69 и 0,66 в группахсравнения, ВУП и РНП, соответственно.

Достоверных различий при этом не былоопределено. При исследовании частот генотипов было выявлено два маркера – генотип GGбыл ассоциирован с отсутствием развития внутриутробной инфекции, т.е. можно считать его«протективным». В то же время наличие генотипа GА ассоциировано с развитием инфекцииу плода. Можно предположить, что нарушение экспрессии цитокина IL17 у родильницыможет служить причиной инфицирования плода.На следующем этапе были исследованы полиморфные маркеры (-1082A>G) и (592A>C) в гене IL10.

Во всех исследуемых группах определялись аллели полиморфногомаркера IL10 (-1082 A>G), но достоверных изменений в распределении не было обнаружено.У родильниц выявлено, что генотип GA (частота которого составила 0,75 относительно 0,47– в группе сравнения) ассоциирован с развитием пневмонии у новорожденных. При этом33генотип АА – является “протективным”. Генотип GG, который определяется как уродильниц, так и у новорожденных является «протективным» относительно развитиявнутриутробной инфекции плода. Частота данного генотипа составляет 0,09 (относительно0,28 в группе сравнений у родильниц) и 0,07 (относительно 0,19 в группе сравнения уноворожденных) (табл.6).Уноворожденных во всех группах доминировал аллель G и генотип GG, нодостоверных отличий между этими показателями в группах выявлено не было. При оценкераспределения аллелей и генотипов полиморфного маркера (-592A>C) в гене IL10 былопоказано следующее.

У родильниц не было определено достоверных ассоциаций частоталлелей и генотипов с внутриутробной патологией плода (ВУП) и новорожденных (РНП). Уноворожденных были найдены две ассоциации: генотип GA - «протективный» маркерразвития внутриутробного инфицирования плода (частота составляла 0,20 относительно 0,42в группе сравнения), маркер GG – ассоциация с риском развития ВУП (частота составляла0,80 относительно 0,58 в группе сравнения).На следующем этапе нами проводился поиск ассоциаций гаплотипов в генах TNFα и IL10 с ранней неонатальной пневмонией и внутриутробной инфекцией.

Известно, чтооднонуклеотидные полиморфные маркеры могут оказывать существенное влияние напредрасположенность индивидуума к той или иной патологии, однако гораздо большеезначение имеет совокупность сцепленных генов на одной хромосоме. Поэтому, помимоисследования связи между однонуклеотидными полиморфизмами G-308A и G4682A в генеTNFα и A-1082G и A-592C в гене IL-10 и патологиями плода, мы провели гаплотипныйанализ.

Сначала был проведен анализ гаплотипов в гене TNFα среди родильниц свнутриутробной инфекцией у плода, ранней неонатальной пневмонией и контрольнойгруппой. В исследуемых выборках из девяти возможных вариантов гаплотипов встречалосьтолько семь.Достоверных отличий при сравнительном анализе гаплотипов группы свнутриутробной инфекцией и контрольной выборки найдено не было.Статистически значимые различия были установлены между группой с ранниминеонатальными пневмониями и контролем. Гаплотип GAGG достоверно чаще встречался припатологии, чем в группе здоровых женщин (0,400 и 0,177, OR = 3, p ≤ 0,01). В гене IL-10 былпроведен анализ шести гаплотипов, остальные три варианта гаплотипов в исследуемыхвыборках не встречались.

При проведении сравнительного анализа распределениягаплотипов между группой с ранней неонатальной пневмонией и контрольной группой,выявили достоверно повышенную частоту гаплотипа AGCC в гене IL-10 (0,455 и 0,185, OR =3,7, p ≤ 0,05). Статистических различий между ранней неонатальной пневмонией и группойсравнения у родильниц при анализе гаплотипов в гене IL-10 выявлено не было.34Таблица 6Распределение аллелей и генотипов маркеров IL10 (-1082A>G) и IL10 (-592A>C) уродильниц и новорожденных в группах с ВУП, с РНП и в группе сравненияIL10 -1082 A>G (rs 1800896)GрGAGG0,490,470,280,41≥0,050,640,09*0,53≥0,050,75*0,16Родильницыгруппа сравн.

1ВУПРНПA0,510,590,47новорожденныегруппа сравн. 1ВУПРНПA0,540,500,56G0,460,500,44Родильницыгруппа сравн. 1ВУПРНПC0,740,690,78IL10 -592 A>C (rs1800872)AрCA0,260,520,31≥0,050,610,22≥0,050,44р≥0,05≥0,05GA0,700,870,66AA0,250,270,09*р<0,05<0,05GG0,190,07*0,23AA0,110,060,11р<0,05≥0,05CC0,480,390,56AA0,000,000,00р≥0,05≥0,05новорожденныеCAрCACC0,790,210,420,58группа сравн. 10,900,10≥0,050,20*0,80*ВУП0,810,19≥0,050,370,63РНППримечание - «*» – показатель достоверно отличается от такового вAAр0,000,00<0,050,00≥0,05группе сравнения1 (здоровые новорожденные без инфекции) (p  0,05).

Для расчета использовали критерий χ2,а также критерий Фишера.Помимо анализа гаплотипов в генах TNFα и IL-10 родильниц исследование было такжепроведено непосредственно среди новорожденных с ранней неонатальной пневмонией ивнутриутробной инфекцией. В гене TNFA из девяти возможных вариантов гаплотипов уноворожденных встречались только четыре, причем во всех исследуемых группахпреимущественно встречался гаплотип GGGG. Таким образом, сравнительный анализраспределений гаплотипов в гене TNFA у новорожденных не выявил достоверных различий вгруппах с ранней неонатальной пневмонией и внутриутробной инфекцией по сравнению сконтрольной группой. Статистически значимые различия при исследовании гаплотипов вгене IL-10 также не были выявлены. Суммируя полученные данные можно заключить, чтогенотипыAG (ген IL10 -1082 A>G) и GG (TNFα -308 G>A) ассоциированы с рискомразвития неонатальных пневмоний. Поиск генетических маркеров, контролирующихразвитие болезней дыхательных путей у новорожденных, на современном этапе стало одной35из важных проблем генетики.