Автореферат (Диагностика неонатальных пневмоний - клинико-микробиологические и иммунологические аспекты), страница 5

В болеетяжелых ситуациях можно рекомендовать комбинации макролидов с монобактамами иамоксиклавом. Таким образом, для проведения этиотропной терапии неонатальныхпневмоний имеется достаточный резерв антибактериальных препаратов.Междузаболеваемостьюноворожденныхнеонатальнымипневмониямиирезистентностью к антибактериальным препаратам имеется умеренная положительная связь20(rxy=0,23; p < 0,05), что свидетельствует о возможности формирования в ОРИТН«госпитальных» штаммов, которые и вызывают данные инфекционные осложнения.Экспрессионный профиль факторов врожденного иммунитета на уровнеслизистых оболочек верхних дыхательных путей новорожденных с ВУП и РНППредрасположенность новорожденных к возникновению инфекционных осложненийможет быть обусловлена не только особенностями госпитальных штаммов микроорганизмов,но и состоянием иммунной системы новорожденных детей.Для успешной борьбы с пневмониями новорожденных требуется знание не толькоклинико-микробиологических, но и иммунологических особенностей данной патологии.

Всвязи с этим одной из задач данной работы являлось изучение микробиоты и факторовврожденного иммунитета (TLR2, TLR4, HBD-1, HBD-2, TNFα и NF-kB) на уровне слизистыхоболочек верхних дыхательных путей при внутриутробном инфицировании плода и развитияранней неонатальной пневмонии.Большое значение виммунитета(Toll-подобныераспознаваниипатогеноврецепторы,цитокины,имеютфакторыврожденногопротивомикробныепептиды)(А.В.Караулов, С.С. Афанасьев, 2017, 2018; Л.В. Ганковская, 2018), которые распознаютконсервативные области микробов.Понимание причин пневмонии новорожденных является сложной исследовательскойпроблемой, поскольку факторы риска и патофизиологические пути заболевания сложны и досих пор плохо изучены.

Не существует единой теории развития пневмонии. Есть много«патологических» путей, которые могут привести к внутриутробной инфекции и/или кразвитию РНП. В работе было показано, что 181 ген имеет отношение к пневмонии, и всеони вовлечены в активацию иммунной системы и воспалительный ответ. Мы также провелисепарацию генов по количеству библиографических источников и рассматривали вдальнейшей работе только те гены, количество работ, посвященных которым, было болеедвух. Проанализировав список генов, имеющих отношение к пневмонии новорожденных, мывыделили наиболее подходящиерецепторы распознавания паттернов, как мембранные,цитоплазматические и другие молекулы.

При анализе использовали данные представленныев базе данных ResNet (Ariadne ® Expression Targets Pathways). Наиболее важными оказалисьосновныемодуляторывоспалительныхсигнальныхпутей,которыеактивируютсябактериальными инфекционными триггерами - TLRs и др. (Yuan TM, 2010; Into T., 2012).На следующем этапе был проведен анализ обогащения по имеющимся картамканонических сигнальных путей (pathway enrichment analysis), в результате которого были21определены сигнальные пути, регулируемые различными гормонами, цитокинами ипептидными лигандами, в которых эти гены были представлены.

Из полученных данныхбыли отобраны сигнальные и регуляторные механизмы с наибольшим представительствомгенов.Наиболее релевантными оказались основные модуляторы воспалительных сигнальныхпутей. Как правило, это опосредованно TLRs и транскрипционным фактором NF-kB.Относительно пневмонии новорожденных нами были выбраны следующие маркеры: TLR2,TLR4, HBD-1, HBD-2, NF-kB и TNFα, которые впоследствии были изучены с точки зренияэкспрессионного профиля. Поскольку эффект активации этих рецепторов осуществлялсячерез транскрипционный фактор NF-kB, то его экспрессионный профиль также былинтересен в работе.

Помимо прочего были выбраны дефенсины, которые играютзначительную роль как в качестве лигандов, так и в качестве эффекторной молекулы.Вероятно, они осуществляют дополнительную положительную регуляцию врожденногоиммунитета на уровне слизистых оболочек.TLR4, TLR2 и TNFαимели прочнуюассоциацию с развитием пневмонии. В целом можно отметить, что используемый намибиоинформационный подход позволили определить круг наиболее значимых сигнальныхкаскадов, которые активируются при пневмонии новорожденных (рис.3).Несмотря на важную роль слизистой респираторного тракта в иммунной защите, наданный момент практически отсутствуют работы, посвященные изучению экспрессиифакторов врожденного иммунитета в эпителиальных клетках слизистой респираторноготракта новорожденных.

В связи с этим было проведено сравнительное исследованиеэкспрессии факторов врожденного иммунитета: TLR2, TLR4, HBD-1, HBD-2, NF-kB и TNFα.В работе проведено исследованиеэкспрессии генов TLR2 и TLR4, участвующих враспознавании большинства бактерий, с которыми “сталкивается” иммунная система впервые дни жизни ребенка. Также провели оценку экспрессии гена транскрипционногофактора NF-kB, который активирует экспрессию генов эффекторных молекул врожденногоиммунитета.

Эти факторы, в свою очередь, приводят к развитию воспалительных реакций вответ на проникновение патогена.Другие молекулы, исследуемые в работе: цитокин TNFα и противомикробные пептидыHBD-1 и HBD-2. TNFα это противовоспалительный цитокин, который участвует в развитиивоспаления при проникновении патогена. HBD-1 и HBD-2 – противомикробные пептиды,которые относятся к дефенсинам, причем HBD-1 экспрессируется конститутивно и егоуровень часто генетически-опосредован, а HBD-2 является индуцибельным пептидом.Рисунок 3.

Карта экспрессионных мишеней канонического сигнального пути привязанного к развитию пневмонииНами было показано, что в эпителиальных клетках верхних отделах респираторноготракта здоровых новорожденных экспрессируются TLRs. В группе здоровых новорожденныхв эпителиальных клетках слизистой респираторного тракта уровень экспрессии генов TLR2составил – 149,7х103 копий исследуемого гена относительно экспрессии гена актина, TLR4 –0,8х103 копий исследуемого гена относительно экспрессии гена актина.Экспрессия TLR2 была сопоставима с показателями у детей других возрастныхкатегорий, в то времякак показатель TLR4 – был достоверно выше на порядок (О.А.Ганковская, 2010). Это можно объяснить тем, что здоровые новорожденные до рождения неконтактируют с инфекционными агентами.

После родов резко увеличивается инфекционнаянагрузка, что может быть ассоциировано с повышенной экспрессией рецепторовврожденного иммунитета. В подтверждение данной теории можно представить данные поэкспрессии рецепторов TLR2 и TLR4 у здоровых новорожденных, у которых определены вверхних дыхательных путях возбудители (E.coli, Acinetobacter, P.aeruginosa, Citribacter идр.).При этом следует отметить, что инфекционной патологии (пневмонии и др.) у этихноворожденных не было выявлено. В группе здоровых новорожденных с возбудителями вэпителиальных клетках слизистой респираторного тракта уровень экспрессии генов TLR2составил – 379,9х103 копий исследуемого гена относительно экспрессии гена актина, TLR4 –0,6х103 копий исследуемого гена относительно экспрессии гена актина.Таким образом, мы можем говорить о достоверном увеличении показателя TLR2 в 2,53раза относительного такового в группе здоровых новорожденных, у которых инфекции невыявлялись.

Активация рецепторов врожденного иммунитета может приводить к запускусигнального пути через NF-kB и к выработке противомикробных пептидов (HBD-2 и др.) ипровоспалительных цитокинов (к примеру, TNFα и др.). Уровень экспрессии ядерногофактора NF-kB в группе здоровых новорожденных составил 5,17х10 3 копий исследуемогогена относительно экспрессии гена актина, а в группе новорожденных с детектируемыминфекционным возбудителем (без патологии) – 10,86х103 копий исследуемого генаотносительно экспрессии гена актина, что в 2,1 раза выше, чем в группе сравнения. Данныйпоказатель может свидетельствовать об активации классического сигнального пути срецепторов TLR.Известно, что экспрессия β-дефенсинов в респираторном тракте приобретает особоезначение у новорожденных, так как эти пептиды способствуют защите плода от инфекции.

Вряде работ показано, что TLR индуцирует экспрессию дефенсинов эпителиальнымиклетками многих тканей (Л.В. Ковальчук, 2011). В связи с этим, одной из задач работыявилось изучение экспрессии генов HBD-1 и HBD-2 в эпителиальных клетках слизистой24верхних отделов респираторного трактау здоровых новорожденных. Были определеныфоновые показатели экспрессии генов HBD-1 и HBD-2, которые составили 7,6 и 39,7 (х103копий исследуемого гена относительно экспрессии гена актина), соответственно. В группездоровых новорожденных с выявленными патогенами данные показатели были значительновыше и составили 14,9 и 182,2 (х103 копий исследуемого гена относительно экспрессии генаактина), соответственно.

Можно утверждать, что наличие патогена в респираторном тракте уноворожденных ведет к активации экспрессии противомикробных пептидов: HBD-1 – в 1,9раз и HBD-2 – в 4,6 раз. При этом уровень эффекторной молекулы TNFα также возрастал в2,3 раза.Суммируя полученные данные можно заключить, что в эпителиальных клеткахреспираторного тракта здоровых новорожденных на фоновом уровне экспрессируютсяисследуемые показатели врожденного иммунитета, а наличие патогена в большинствеслучаев приводит к активации экспрессии этих факторов. Механизмы активации связаны свзаимодействием лигандов (компонентов патогенов) с TLRs. В случае если врожденныйиммунитет на уровне слизистой оболочки респираторного тракта новорожденного адекватнореагирует на патоген, в таком случае, не наблюдается какого-то патологического процесса.Нами проведено исследование экспрессии факторов врожденного иммунитета клеткамислизистой респираторного тракта новорожденных с пневмонией (табл.2).У новорожденных с ВУП выявлено умеренное снижение показателя TLR2 и резкоеугнетение экспрессии гена TLR4 в 2,24 раза.

Показатели дефенсинов при этом практическине отличались от нормы. У пациентов с РНП также наблюдалось небольшое снижениеэкспрессии гена TLR2 в 1,5 раз и TLR4 – в 1,75 раз. При этом у новорожденных спневмонией наблюдался четкий рост уровня экспрессии гена провоспалительного цитокинаTNFαиядерногофактораNF-kB,чтоможетсвидетельствоватьобактивациивоспалительных реакций на уровне слизистых оболочек. Следует отметить, что даннаяактивация происходит на фоне супрессии экспрессии генов рецепторовДалее нами был проведен корреляционный анализ полученных результатовпредставленных в табл.3.