Автореферат (Исследование микробиоты кишечника при болезни Паркинсона), страница 2

Автором дано обобщение результатов и его научноеобоснование, сформулированы выводы.Структура и объем диссертацииДиссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15таблицами и 35 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, описания материала иметодовисследования,изложениясобственныхрезультатов,заключения,выводов,библиографического указателя, включающего 304 источника.ПубликацииПо теме диссертации опубликовано 10 работ, из них в научных рецензируемых изданиях,рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований – 5 (4оригинальных исследования, 1 обзорная работа); 2 зарубежные публикации; статьи, входящие вбазы данных Web of Science и/или Scopus – 6; 2 свидетельства о регистрации результатовинтеллектуальной деятельности.Основное содержание работыВо введении приведено описание актуальности исследования и степени разработанностиего темы; описаны цели и задачи работы, ее научная новизна и практическая значимость.

Такжеуказаны положения, выносимые на защиту, изложена краткая структура диссертации, описанастепень достоверности и апробация результатов.Перваяглавапредставляетсобойобзористочниковлитературы,посвященныхособенностям состава микробиоты человека и методологическим подходам к ее исследованию;связи микробиоты с работой организма, в частности оси «мозг-кишечник-микробиота»; а так жеинформации об эпидемиологии и патогенезе болезни Паркинсона (далее БП).Во второй главе приведено описание дизайна и объектов исследования, использованногоматериала и методов. Исследование проведено на базе Центральной научно-исследовательскойлаборатории ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (г.Томск), набор биологическогоматериала от участников исследования проводился на базе кафедры неврологии инейрохирургии СибГМУ, секвенирование бактериальной ДНК осуществлялось в ФНКЦ ФХМФМБА России.6В исследование были включены 93 пациента с БП, 66 пациентов группы здоровогоконтроля, а также 33 пациента с иными неврологическими заболеваниями в качестве группысравнения.

Медиана возраста пациентов в группе БП составила 69 [64; 76] лет. Критериямивключения пациентов в группу БП послужили: возраст от 18 до 88 лет; документальноподтверждѐнный диагноз БП, выставленный в соответствии с международными клиникодиагностическими критериями Банка головного мозга общества болезни ПаркинсонаВеликобритании; наличие подписанной формы информированного согласия на участие вданном исследовании.Медиана возраста пациентов в контрольной группе составила 52 [40; 62] года.

Критериямивключения пациентов в контрольную группу послужили: возраст от 18 до 88 лет; отсутствие упациентов любых нейродегенеративных и воспалительных заболеваний нервной системы;наличие подписанной формы информированного согласия на участие в данном исследовании.В группу сравнения вошли пациенты со следующими заболеваниями: рассеянный склероз— 15 пациентов, эссенциальный тремор — 10 пациентов, идиопатическая семейная дистония— 5 пациентов, а также по одному пациенту с диагнозами множественная системная атрофия,деменция с тельцами Леви и острый рассеянный энцефаломиелит.

Медиана возраста пациентовв группе сравнения составила 58 [38; 66] лет. Критериями включения пациентов в группусравнения послужили: возраст от 18 до 88 лет; наличие любого идиопатическогодегенеративного либо воспалительного заболевания нервной системы, за исключением болезниПаркинсона; наличие подписанной формы информированного согласия на участие в данномисследовании.Всем пациентам проводилось клиническое обследование и неврологический осмотр. Укаждого пациента был собран биоматериал — кал. Биоматериал замораживался до -20 С и втечение двух часов доставлялся в лабораторию, где хранился до востребования притемпературе -80 С. Из биоматериала каждого участника эксперимента проводилось выделениетотальной бактериальной ДНК методом спиртового осаждения в присутствие космотропнойсоли с предварительным химическим, механическим и термическим лизисом бактериальныхклеток.Ампликонное секвенирование микробиоты по маркерному фрагменту V3-V4 генабактериальной 16S рРНК осуществляли согласно протоколу 16S Metagenomic SequencingLibrary Preparation (Part #15044223 Rev.

B), рекомендованному Illumina для секвенатора MiSeq.Анализ прочтений секвенатора осуществлялся с использованием программного обеспеченияQIIME 1.9.1 (J.G.Caporaso et al, 2010). Файлы прочтений фильтровались по качеству букв (баллпо Phred не менее 19) и длине прочтения (не 120 пар оснований). В качестве референсной базыданных для определения таксономического положения прочтений использовались базы7GreenGenes версии 13.5 и HITdb и алгоритм RDP classifier (T.Z.DeSantis et al, 2006; Q.Wang et al,2007; J.Ritari et al, 2015).Расчет индексов разнообразия проводился с использованием программного обеспеченияQIIME 1.9.1. Для оценки α-разнообразия рассчитывались индексы Шеннона, Chao1 и общегочисла ОТЕ при прореживании данных до 1800 ОТЕ/образец.

Сравнение проводили сиспользованием непараметрического t-теста Уэлча при 9999 перестановках.Длярасчетаиндексаβ-разнообразиязначенияпредставленностиоперационныхтаксономических единиц нормализовали при помощи алгоритма CSS (J.N.Paulson et al, 2013).Затем применяли неметрическое многомерное шкалирование в трех измерениях в метрикеweighted Unifrac (C.A.Lozupone et al, 2007).

Для определения достоверности попарного различиясообществ по составу микробиоты и вклада исследуемых заболеваний в данное различиеиспользовался метод ANOSIM и непараметрический дисперсионный анализ с оценкойзначимостипри9999микроорганизмами,перестановках.входящимивДлясоставоценкикорреляционныхмикробиотическогосвязейсообщества,междустроиликорреляционные графы в пакете CoNet (K.Faust et al, 2012) программного обеспеченияCytoScape (P.Shannon et al, 2003).Поиск различий в таксономическом составе микробиоты кишечника проводили приагрегации ОТЕ по отдельным таксономическим уровням.

Для поиска дифференциальнопредставленных таксонов применяли модель fitZig пакета metagenomeSeq языка R (J.N.Paulsonet al, 2013) с добавлением ковариаты «возраст». Различия считали значимыми при значениир<0,05 после применения поправки на множественные сравнения по методу БенджаминиХохберга. Метаболическая реконструкция функционального состава микробиоты относительнопутей синтеза витаминов и короткоцепочечных жирных кислот проводилась с использованиемсервиса knomics/biota.Для микроорганизмов-биомаркеров использовались методы обучения по прецедентам.Обучение проходило в три этапа: отбор наиболее значимых признаков, обучение моделей,проверка моделей на валидационной выборке. Отбор наиболее значимых признаков и обучениепроводились в пакете caret (M.Kuhn, 2008) языка программирования R с использованиемалгоритма RFE.

В качестве вариантов классифицирующих моделей рассматривали следующиеалгоритмы: метод частичных наименьших квадратов (далее PLS), наивный байесовскийклассификатор (далее NB), обобщенную линейную модель (далее GLM), искусственнуюнейронную сеть с сигмоидной активационной функцией (далее NNET) и машину опорныхвекторов (далее SVM). После проведения обучения все модели проходили проверку навалидационной выборке.Третья глава включает в себя описание результатов проведенного исследования с их8обсуждением.

Важным интегральным параметром, характеризующим состав флоры, является еевидовое разнообразие. У пациентов с БП также, как и у больных с другими неврологическимизаболеваниями, отмечалось достоверное снижение видового богатства в кишечной микробиотепо нескольким индексам α-разнообразия по сравнению с контрольной группой. В группе БП ипри других неврологических заболеваниях наблюдалось снижение общего количестваотдельных разновидностей ОТЕ, что описывается индексом observed OTUs (p=0,003 и p=0,002,соответственно), и уменьшение доли редких разновидностей ОТЕ, о чем свидетельствуетнизкий индекс Шеннона (p=0,006 и p=0,008 соответственно). Более «взвешенная» оценкаразнообразия индексом Chao1 также свидетельствует о снижении богатства бактериальнойфлоры у больных (p=0,003 и p=0,023).Низкий уровень α-разнообразия микробиоты зачастую свидетельствует о протеканиипатологических процессов в месте колонизации, в частности воспаления (S.Lapthorne et al,2013).

Кроме того, снижение таксономического разнообразия микробиоты кишечниканаблюдается и в случае системных, но топически не связанных с желудочно-кишечным трактомзаболеваниях — например при артериальной гипертонии (J.Li et al, 2017). Поскольку в группепациентов с другими неврологическими заболеваниями видовое богатство микробиоты такжеснижалось, можно предположить, что снижение α-разнообразия является неспецифическойреакцией на наличие заболевания.При количественной оценке вклада состояния пациентов в β-разнообразие микробиотыустановлено, что наличие того или иного заболевания имеет значимое влияние на составкишечной микробиоты.

Так, по результатам применения непараметрического дисперсионногоанализа, диагноз объясняет порядка 10% вариабельности микробиоты (R2=0,103, p=0,0001).Использование имитационного анализа сходства также подтверждает вклад диагноза пациентовв состав флоры (R2=0,123, p=0,0001). При оценке влияния других известных факторов насовокупный состав микробиома с использованием непараметрического дисперсионного анализаобнаружен небольшой, однако, достоверный вклад возраста (R2=0,019, p=0,0007). Однако, поданным имитационного анализа сходства, обнаружено, что возраст достоверного влияния насостав микробиоты кишечника не имеет (R2=0,037, p=0,141). Различия в β-разнообразиисоотносятся с результатами, полученными другими коллективами при исследованиимикробиоты пациентов с БП (F.Hopfner et al, 2017; E.M.Hill-Burns et al, 2017; A.Keshavarzian etal, 2015).Анализ корреляционных сетей бактерий микробиоты кишечника, также подтверждаетнаблюдаемое снижение таксономического разнообразия у пациентов с БП.