Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, страница 5

Известно, что винилсульфон можетсвязывать тиольную группу в активном центре цистеиновых протеаз. Винилсульфоноваягруппа, соединенная с подходящим пептидом, может специфично и необратимо связыватьтреонин в активном центре протеасомы. Примером ингибиторов этого класса является ZLеu-Leu-Leu-VS, в концентрациях 1-5 мкМ связывающийся преимущественно ссубъединицей β5 [46].Z-Lеu-Leu-Leu-VS3) Пептидные производные борной кислоты. Медленно связывающиеся обратимыеингибиторы с малой скоростью диссоциации.

Их преимущество перед другими типамиингибиторов – малый размер молекулы, всего два аминокислотных остатка, чтообуславливает хорошую растворимость и способность проходить через клеточныемембраны. К этому типу ингибиторов относится PS-341 (бортезомиб) – препарат,используемый в терапии множественной миеломы. В наномолярных концентрацияхспецифично ингибирует химотрипсин-подобную активность in vitro и in vivo.

Раковыеклетки более чувствительны к остановке клеточного цикла, вызываемой ингибированиемпротеасомы, что обуславливает эффективность бортезомиба в терапии множественноймиеломы.21PS-3414) Эпоксикетон-производные пептидов. Ковалентно и необратимо связываются спротеасомой, образуя морфолиновое кольцо при взаимодействии с N-концевойаминогруппойвактивномлабораторнойпрактикецентреширококаталитическихприменяетсясубъединицэпоксомицинпротеасомы.В(Ac-Ile-Ile-Thr-Leu-эпоксикетон) который в концентрации <100 нМ связывает все каталитическиесубъединицы протеасомы.MG-132Еще один ингибитор этого класса, CFZ (карфилзомиб), связывающий β5 и β5i внаномолярных концентрациях, также применяется в терапии множественной миеломы[47].Карфилзомиб5) Производные лактонов.

Блокируют в основном активность по типу химотрипсина, приэтом лактонное кольцо необратимо ацилирует треонин в активном центре. Некоторые изэтих соединений, например лактацистин, для активации требуют перестройки структуры вактивный β-лактон. На практике такая перестройка происходит в водном растворе после 122часа инкубации при 37˚С. Активация лактацистина происходит с отщеплением Nацетилцистеина [48].Лактацистин воздействует в основном на химотрипсин-подобную активность c IC50=70нМ, IC50 для активностей других типов приблизительно в 100 раз выше.6) Ингибитор смешанного действия – ритонавир. Ритонавир является ингибиторомаспартильной протеазы ВИЧ, но в микромолярных концентрациях также обратимоконкурентно ингибирует протеасому, снижая ее активность по типу химотрипсина, ноповышая активность по типу трипсина.

Взаимодействует как с активными центрамикаталитическихсубъединиц,такиснекаталитическимсайтом,осуществляяаллостерическую модуляцию активности протеасомы [49].Ритонавир7) Неконкурентные ингибиторы. Соединения этой группы не взаимодействуют сактивным центром. Являясь аллостерическими регуляторами, они взаимодействуют снекаталитическими частями протеасомы, изменяя ее активность. Наиболее хорошо изученмеханизм действия PR-пептидов. Пептид, богатый пролином и аргинином, состоящий из39 аминокислотных остатков, и его N-концевой фрагмент из 11 аминокислотных остатков23взаимодействуют с 7 субъединицей 20S протеасомы, и из-за этого меняются параметрыканала, ведущего к каталитическим центрам протеасомы [50].Как уже упоминалось ранее, субъединицы β1 и β1i, а также β2 и β5i отличаются друг отдруга по структуре активного центра.

Это делает возможным создание ингибиторов,селективно воздействующих на иммуносубъединицы протеасомы. К β1i-специфическимингибиторам относятся пептидилэпоксикетон UK-101 [21], пептидилальдегид IPSI-001 (ZLnL-CHO) [51], пептидилэпоксикетон YU-102 [52]. β5i-специфическими ингибиторамиявляются пептидилэпоксикетон PR-924 и пептидилэпоксикетон ONX0914 (PR-957) [53].IC50 по отношению к индивидуальным субъединицам протеасомы для этих соединенийприведены в таблице 1.Таблица 1.

IC50 селективных ингибиторов иммунопротеасомы [54]IC50, мкМИнгибиторКонститутивная протеасомаИммунопротеасомаUK-10114 (ex vivo)2 (ex vivo)IPSI-0011.03 ± 0.17 (химотрипсинподобная активность)105 ± 1.3 (химотрипсин-подобнаяактивность)YU-1020,209 (β1), >5 (β2), >1 (β5)0,046 (β1i), >5 (β2i и β5i)Β5i -PR-957~0,5 (β5)~0,01 (β5i)специфическиеPR-9242,9 (β5)0,022 (β5i)β1i специфические24Совсем недавно были также идентифицированы три непептидных ингибитора,нековалентно взаимодействующих с активным центром субъединицы β5i.

Их IC50 поотношению к химотрипсин-подобной активности иммунопротеасомы составляют 1.7 мкМдля соединения 1, 4,9 мкМ для соединения 2, 22 мкМ для соединения 3 [55].Презентация антигенов на молекулах главного комплекса гистосовместимостиПри попадании антигена в организм запускается процесс адаптивного иммунногоответа, который включает три основных события:- распознавание антигена функционально незрелыми (наивными) Т- и В-клетками- ответная реакция этих клеток на антиген в виде пролиферации и дифференцировкидо зрелых эффекторных клеток- эффекторная фаза – нейтрализация и уничтожение антигена.В-клетки способны распознавать свободные, не связанные с какими-либо другимибелками антигены; они выделяют антитела, которые уничтожают внеклеточные антигены,например бактерии, но не могут взаимодействовать с вирусами, размножающимисявнутри клетки.

Зараженные вирусом клетки узнаются Т-лимфоцитами, которые отвечаютнакомплексыантигенныхгистосовместимости(МНС)пептидовIилиIIскласса,молекуламиглавногопредставленныенакомплексаповерхностиантигенпрезентирующих клеток (АПК). В отличие от В-клеток, Т-клетки не способныраспознавать свободные, не связанные с молекулами MHC антигены.Молекулы MHC двух классов имеют различные, хотя и связанные между собойфункции. Молекулы MHC I презентируют пептиды Т-клеткам, которые экспрессируютвспомогательную молекулу CD8, а молекулы MHC II презентируют пептиды CD4положительным Т-клеткам.

Чтобы Т-клетки могли активироваться и участвовать виммунном ответе, расположенный на их поверхности антиген-специфический рецептор и25соответствующие вспомогательные молекулы должны прореагировать с комплексомМНС-антигенный пептид. Активированные СD4+ Т-клетки начинают вырабатыватьцитокины, обладающие выраженным иммунорегуляторным эффектом.

АктивированныеCD8+ Т-клетки уничтожают зараженные вирусами или трансформированные клетки [56].На поверхности каждой клетки презентировано приблизительно 10000 различныхпептидов, которые представляют практически все клеточные белки; каждому белкусоответствует один или несколько пептидов [57].Молекулы MHC II класса экспрессируются на поверхности клеток практическилюбого типа; тем не менее, процессинг и презентация антигена в разных типах клетокидут с заметно различающейся эффективностью. Это позволяет выделять несколько типовклеток: макрофаги, В-лимфоциты и дендритные клетки (DC), в особую группу –«профессиональные» антиген-презентирующие клетки (АПК) [58].

На молекулах MHC IIкласса презентируются внеклеточные антигены. Процессинг антигена начинается сэндоцитоза, в результате чего антиген оказывается заключенным в фаголизосомы иподвергается действию протеаз. Во внутреннем пространстве ЭПР формируютсямолекулы II класса MHC, которые защищены инвариантной цепью от случайноговзаимодействия с пептидами. На следующем этапе происходит слияние фаголизосомы спептидными фрагментами с вакуолью, содержащей комплекс молекула MHC II классаинвариантная цепь. Фаголизосома содержит сериновые и аспарагиновые протеазы,называемые катепсинами.

Они расщепляют инвариантную цепь, оставляя лишь CLIPфрагмент (ClassII-associated Invariant chain Peptide), который занимает антигенсвязывающий участок молекулы MHC; эти же протеазы расщепляют антиген доотдельных пептидов. Образовавшийся комплекс MHC II-антигенный пептид в составесекреторной гранулы перемещается к клеточной поверхности. Затем CLIP-фрагментзаменяется на антигенный пептид, и образовавшийся комплекс MHC II-антигенныйпептид в составе секреторной гранулы перемещается к клеточной поверхности.

(Рис. 6).26Рисунок 6. Процессинг внеклеточных антигенов и их презентация на MHC II. Адаптировано из [59].Процессинг антигенов, презентирующихся на молекулах МНС I класса.В комплексе с молекулами MHC I класса, как правило, презентируются пептидыбелков, синтезирующихся внутри клетки и локализующихся в цитозоле. В нормальнойситуации все презентируемые пептиды происходят из нормальных внутриклеточныхбелков и поэтому не узнаются Т-клетками. В патологических ситуациях, например приинфицировании клетки вирусом, на MHC I, помимо собственных, презентируютсячужеродные пептиды. Чужеродные пептиды узнаются Т-лимфоцитами, что можетпривести к уничтожению такой клетки.Процессинг антигенов начинается с убиквитинилирования антигенного белка и егофрагментации протеасомой, а также другими протеазами (Рис.

7). Образовавшиесяпептиды проникают во внутреннее пространство эндоплазматического ретикулума (ЭПР)с помощью белков TAP1 и TAP2 (transporter associated with antigen processing). Вовнутреннем пространстве ЭПР пептиды могут подвергаться действию ферментов, которыеотщепляют одну или несколько аминокислот с N-конца, после чего пептиды образуюткомплекссгетеродимернымимолекуламиMHCIкласса.Ферментыскарбоксипептидазной активностью в просвете ЭПР отсутствуют. Молекула МHC и пептид27должны строго соответствовать друг другу по структуре, чтобы образовать комплекс,поэтому каждая конкретная молекула MHC может связать только пептид определеннойаминокислотной последовательности.