Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, страница 2

97СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................................... 984СПИСОК СОКРАЩЕНИЙа.о. – аминокислотный остатокАт – антителоАТФ - аденозинтрифосфатАПК – антигенпредставляющая клеткаВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматографияГЭБ – гематоэнцефалический барьерДМСО – диметилсульфоксидИП - иммунопреципитациякДа – килодальтонПААГ – полиакриламидный гельРС – рассеянный склерозТКР – т-клеточный рецепторЦНС – центральная нервная системаЭПР – эндоплазматический ретикулумBSA – бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin)CaM - кальмодулинEAE – экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (experimental autoimmuneencephalomyelitis)GA – глатирамера ацетат (glatiramer acetate)HLA – лейкоцитарный антиген человека (Human Leucocyte Antigen)IFN – интерферонIgG – иммуноглобулины класса GIL – интерлейкин5MBP – основный белок миелина (myelin basic protein)MHC – главный комплекс гистосовместимости (major histocompatibility complex)MOG – миелин-олигодендроцитарный гликопротеин (myelin oligodendrocyte glycoprotein)MRM – мониторинг множественных реакций (multiple reaction monitoring)ODC – орнитиндекарбоксилаза (ornithine decarboxylase)PBS – фосфатно-солевой буфер (phosphate buffered saline)PLP – протеолипидный белок (proteolipid protein)SDS – додецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulfate)SPR – поверхностный плазмонный резонанс (surface plasmon resonance)siRNA – малая интерферирующая РНК (Small interfering RNA)TBS – солевой буфер на основе трис(гидроксиметил)аминометана (tris-buffered saline)Th – Т-хелперыTr, Treg – Т-регуляторные клеткиWB – вестерн-блоттинг (western blotting)6ВВЕДЕНИЕОдним из распространенных аутоиммунных заболеваний является рассеянныйсклероз (РС) – хроническое воспалительное нейродегенеративное заболевание снеизвестной этиологией.

Патогенез данного заболевания включает в себя повреждениемиелиновой оболочки нервных волокон, что приводит к постепенной утрате целого рядафункций центральной нервной системы, связанных с физическим и психоэмоциональнымсостоянием больного. Первые эпизоды РС обычно происходят в молодом возрасте (20-40лет) и в этой связи последующая инвалидизация больных обуславливает важноесоциально-экономическое значение РС.

Заболевание длится годами, и терапия больныхРС ложится тяжким бременем на бюджеты большинства развитых стран. Из-за неясностиэтиологии на сегодняшний день не существует радикального способа терапии,приводящего кполному излечению пациента. Современные лекарства в своембольшинстве действуют на клетки иммунной системы, подавляя процессы воспаления, темсамым уменьшают лишь частоту обострений или несколько замедляют развитиезаболевания.Дляизученияфундаментальныхосновразвитияаутоиммуннойнейродегенерации и, в частности, РС, а также для проведения доклинических испытанийразличных фармацевтических препаратов используется экспериментальная животнаямодель РС – экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE).Одним из основных аутоантигенов, на который направлен иммунный ответ прирассеянном склерозе и EAE, является основной белок миелина (myelin basic protein, MBP).Известно, что экспрессия основного белка миелина в организме млекопитающихобнаруживается исключительно в центральной и периферической нервных системах.Данный белок содержится в мембране специализированных клеток, формирующихмиелиновую оболочку аксонов, – олигодендроцитов и Шванновских клеток.В аутоиммунной демиелинизации при РС и EAE принимают участие Т- и Bлимфоциты, а также другие клетки иммунной системы.

Основную роль в разрушениимиелиновых волокон и координации аутоиммунной атаки на ЦНС отводят CD4+ Tлимфоцитам (T-хелперам) подтипов Th1 и Th17. Однако результаты исследованийпоследнего десятилетия однозначно свидетельствуют о том, что цитотоксические CD8+ Tлимфоциты (CTL) также играют важную роль в патогенезе PC и EAE.Для того, чтобы специфичные к определенному антигену CD8+ цитотоксическиелимфоциты могли лизировать таргетную клетку, они должны распознать антигенныепептиды, презентированные на поверхности атакуемой клетки на молекулах главного7комплекса гистосовместимости первого класса (MHC I).

Антигенные пептиды образуютсяиз внутриклеточных белков под действием антипода рибосомы – так называемой 26Sпротеасомы–мультисубъединичногобелковогокомплекса,обладающегопротеолитической активностью. Большинство белков распознается и гидролизуетсяпротеасомой только в форме ковалентного конъюгата с цепью молекул убиквитина. Длямаркирования белков, предназначенных для деградации протеасомой, в клетке существуеттрехступенчатая система ферментов – убиквитин-лигаз. Пептиды, полученные врезультате протеолиза внутриклеточных белков протеасомой, транспортируются впросвет эндоплазматического ретикулума. Там они загружаются на молекулы главногокомплекса гистосовместимости первого типа и затем экспонируются на поверхностиклетки, образуя своеобразный молекулярный паспорт клетки.В настоящее время становится понятным, что молекулярные механизмы деградацииаутоантигенов и их презентация тесно связана с развитием РС.

Данная диссертационнаяработа посвящена механизмам деградации основного белка миелина протеасомой ипрезентации образующихся пептидов на молекулах MHC I как одного из этаповпатогенеза PC.8ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫПротеасомаСтруктура и каталитические свойства протеасомыПротеасома–многосубъединичныйбелковыйкомплекс,обладающийпротеолитической активностью.

Он присутствует в ядрах и цитоплазме клеток некоторыхпрокариот и всех эукариот. Протеасомой названы два типа частиц разного строения,отличающихся молекулярной массой и коэффициентом седиментации. 20S протеасома смолекулярной массой 700 кДа и коэффициентом седиментации 20S в качествепротеолитического ядра входит в состав более сложной частицы – 26S протеасомы (Рис.1).Рисунок 1. Структура 26S протеасомы человека. Серым цветом обозначено 20S ядро, синим и фиолетовым– нижний (базовый) элемент 19S регулятора, желтым – верхний элемент 19S регулятора [1].По данным рентгеноструктурного анализа, 20S протеасома представляет собой полыйцилиндр длиной 15-17 нм и диаметром 11-12 нм, состоящий из четырех лежащих друг надругеколец,причемдваодинаковыхпериферическихкольцасформированысубъединицами α-типа, а два одинаковых центральных кольца – субъединицами β-типа(Рис.

2). Каждое из колец состоит из 7 субъединиц, массой 20-35 кДа каждая. Каналвнутри цилиндра, расширяясь, образует три камеры: большую центральную, в которойосуществляется протеолиз, и две меньшие камеры по краям [2].9Рисунок 2. β-субъединицы в структуре протеасомы, вид по оси цилиндра [1].Три из β-субъединиц (β1, β2 и β5) ответственны за каталитическую активность, накаждой из них локализовано по одному каталитическому центру, а N-концевые остаткитреонина этих субъединиц действуют как нуклеофилы [3].Строениекаталитическихцентровбылоустановленометодамирентгеноструктурного анализа, а каталитически важный остаток – методом мутагенеза [4].В ходе реакции протон гидроксильной группы триптофана переносится на аминогруппуэтой же аминокислоты, а молекула воды в активном центре действует как основание.

Поподобному механизму работают еще три других фермента: пенициллинацилаза (вактивном центре N-концевой серин), глутамин-амидотрансфераза (в активном центре Nконцевой цистеин), аспартилглюкозаминидаза (в активном центре N-концевой треонин).В эукариотической протеасоме 4 из 7 β-субъединиц содержат N-концевой треонин. Крометого, есть предположения, что аминокислотные остатки Lys33 и Glu17 также находятся в10активном центре иучаствуют в катализе.

α-субъединицы не имеют каталитическойактивности, но важны для поддержания структуры протеасомы. При диссоциации насубъединицы каталитическая активность утрачивается полностью, что указывает наважную роль взаимодействий между субъединицами.Протеасома обладает широкой субстратной специфичностью. Наибольшее влияниена кинетические параметры протеолиза оказывает аминокислотный остаток в положенииP1. Выделяют 3 основных типа протеолитической активности протеасомы: активность потипу трипсина (расщепление полипептидной цепи после положительно заряженныхаминокислотных остатков), активностьпо типу химотрипсина (после ароматическихаминокислотных остатков), активность по типу каспазы (после отрицательно заряженныхаминокислотных остатков) [5].

Протеолиз по типу каспазы осуществляется, в основном,β1 субъединицей, по типу трипсина – β2 субъединицей, по типу химотрипсина – β5субъединицей [6]. Помимо основных типов активности, протеасома обладает еще инесколькими дополнительными и способна расщеплять полипептидную цепь практическимежду любыми аминокислотными остатками. Кроме того, на связывание с активнымицентрами каталитических субъединиц и эффективность расщепления той или инойпептидной связи влияет не только аминокислотный остаток в P1-позиции, но иаминокислотные остатки в P2, P3 и P4 позициях [7-9].Для протеолиза белка скорость-лимитирующей является химотрипсин-подобнаяактивность протеасомы.

Ингибирование или инактивация методом мутагенеза трипсин- икаспазо-подобной активности оказывают гораздо меньшее влияние на скорость гидролизаполипептидной цепи. Поскольку все три каталитические субъединицы являются частьюединого комплекса, они аллостерически влияют на активность друг друга. Связываниесубстрата химотрипсин-подобной активности увеличивает каспазоподобную активность, асвязывание субстрата каспазоподобной активности ингибирует химотрипсин-подобнуюактивность. Предполагают, что при гидролизе полипептидной цепи сначала активируетсяхимотрипсин-подобный сайт, который расщепляет ее на пептидные фрагменты, затем этотхимотрипсин-подобный сайт аллостерически инактивируется и каспазоподобный сайтрасщепляет образовавшиеся на первой стадии пептиды на более мелкие фрагменты, послечего активные центры освобождаются и цикл повторяется [10].В норме 20S протеасома существует в неактивном состоянии, так как α-субъединицыза счет своих N-концевых гидрофобных участков блокируют вход в каталитическуюполость, препятствуя случайному протеолизу.

Скорость гидролиза пептидов существенноувеличивается при открытии входов в каталитическую полость. Они открываются присвязывании с регуляторными белковыми комплексами: 19S регуляторным комплексом и11активатором PA28, при наличии определенных мутаций в структурных субъединицах [11],и при обработке некоторыми химическими соединениями, например SDS в низкихконцентрациях [12]. Однако даже в присутствии регуляторных комплексов белковыесубстраты должны находиться в растянутой или развернутой конформации, чтобыпопасть в каталитическую полость [13].Регулятор РА28 – гептамерный комплекс массой 180-200 кДа, состоит из IFNγиндуцибельных α и β-субъединиц.