Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности, страница 11

Применяя технику фаговогодисплея, в работе [110] впервые были получены малоактивные мутанты по остатку bN241 –bN241S и bN241G, для которых при более чем 40-кратном падении kcat наблюдали 3-5кратное улучшение KM в реакции гидролиза NIPAB. Малоактивные мутанты, сохранившие67способность к связыванию, авторы планируют использовать в дальнейшем для скринингановой специфичности.В заключении хотелось бы отметить, что на сегодняшний момент в отношении ПАреализованы практически все ранее разработанные подходы белковой инженерии. Начиная с80-х годов параллельно появлялись работы по случайному и направленному мутагенезу ПА(диагр.

1). Накопление информации о структурно-функциональных особенностях ПА иусовершенствованиетехникискринингапривелокпоявлениюсовременныхкомбинированных методов, развитие которых, на наш взгляд, в дальнейшем будет во многомопределять тенденции и успехи белковой инженерии ПА и других ферментов.3количество статей, штСлучайный мутагенез2Комбинированные методыНаправленный мутагенез101985 1987 1989 1991 1993 1995 1997 1999 2001 2003 2005 2007 2009 2011год выпускаДиаграмма 1. Количество статей по белковой инженерии ПА.1.2.3 ЗаключениеесПА весьма хорошо изучена и представляет большой интерес для биотехнологии.Скрининг природных ПА позволяет найти новые ферменты, однако их каталитическиевозможности ограничены.

На текущий момент найдены природные ПА, которыесущественно превосходят ecПА по специфичности к Сα-замещенным ФУК (asПА),каталитической активности в отношении гидролиза NIPAB (PAS2, afПА, axПА) и реакции пG(afПА, asПА), термо- (axПА, afПА, ttПА) и щелочной стабильности (afПА, bmПА, kcПА), атакже эффективности ацильного переноса (PAS2, krПА).68С помощью белковой инженерии на сегодняшний момент получены ПА с улучшеннойспецифичностью к Сα-замещенным ФУК (bF24A, aF146Y), стереоспецифичностью (bF24X,aF146X),каталитическойактивностью(NEGM-ПА,bG70D,bF71L,bF71C,afПАT206G+S213G), термо- («B10», kcПА M168A, aW25Y, aA80R, aT150N, bA84P, bL100E,bA305D, bT311P+bQ312A, bN348D, bV359LbV400L, bmПА bK427A, bmПА bK430A), pH(bF71C, bF71L, bW431) и операционной стабильностью (bmПА bK427A, bmПА bK430, afПАT206G+S213G). Мутанты ecПА по остаткам bF24, aF146, aF145, aD148, bG375, а такжегибридные 6G8, 73C4, 6B11, превосходят ecПА ДТ по эффективности ацильного переноса вреакциях синтеза бета-лактамных антибиотиков.Однако, многие найденные или полученные ПА, обладая каким-либо полезнымсвойством, отличным от ecПА ДТ, «утрачивают» другие, например, приобретаяпреимущества в эффективности синтеза, теряют в каталитической активности.

Так,наилучшие в синтезе бета-лактамных антибиотиков мутанты на основе bF24A практическиполностью утратили амидазую активность и не могут использовать D-ФГА в качествеацильного донора. Для других препаратов, превосходящих ecПА ДТ по эффективностиацильного переноса (β) и относительной специфичности (α), суммарные эффектынедостаточны для проведения препаративного синтеза.

На сегодняшний момент нетпрепаратов с приемлемой стереоселективностью по отношению к ряду первичных аминов иаминоспиртов, ecПА ДТ нестабильна в щелочной среде, которая необходима для проведенияэффективного ацилирования аминосоединений, а также в пептидном синтезе. Неизвестныпрепараты есПА устойчивые при высоких концентраций реагентов, что ограничиваетпрепаративные возможности пептидного синтеза с использованием ПА. В связи свышеобозначеннымипотребностямипредставляетсянеобходимымпоискболееэффективных препаратов на основе ecПА.692 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1 Материалы и оборудованиеПеречень используемых материалов приведен ниже.Ферменты: Набор для проведения высокоточного ПЦР: Taq ДНК-полимераза + PfuДНК-полимераза, High Fidleity PCR Enzyme Mix, 5ед/мкл, Fermentas, США; Taq ДНКполимераза, 5ед/мкл, Fermentas, США; Набор эндонуклеаз рестрикции: AclI, AluI, AlwNI,BclI,BglII, BsaI, DpnI, EcoRI,EcoRV, HindIII, NcoI, NdeI, NruI, PvuI, 10ед/мкл, (а также серииFast Digest® для быстрого гидролиза), Fermentas, США; T4 ДНК-лигаза: 5ед/мкл, Fermentas,США.Штаммы E.coli: TG-1 (supE hsdΔ5 thi Δ(lac-proAB) F`[traD36 proAB+ lacIqlacZΔM15]); XL1-Blue (recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proABlacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]).Реактивы для молекулярной биологии: Набор dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 100мМ,Хеликон, Россия; Маркер молекулярного веса ДНК: 5000-100нп, 4нг/мкл, FastRuler MiddleRange DNA Ladder, Fermentas, США; 1000-100нп, 10-1.25нг/мкл, FastRuler Express ForwardDNA Ladder Mix, Fermentas, США; Краска для электрофореза: раствор с красителями длянанесения на гель (бромфеноловый синий, ксилен циановый FF, оранжевый Ж), 6х TriTrackDNA Loading Dye; Буфер для электрофореза: 50x TAE Electrophoresis Buffer, Fermentas,США; Этидий бромистый: 10мг/мл, BG, Хеликон, Россия; Агароза: BG, Хеликон, Россия;Наборы для выделения и очистки ДНК: Емкость колонки 25мкг ДНК, Цитокин, Россия;Среда LB: LB Broth, Miller, TCG, Amersco, США; Дрожжевой экстракт бессолевой: Хеликон,Россия; Агар: B, Хеликон, Россия; Хлорамфеникол*: >99%, Sigma, США; Набор длятрансформации: Transform AidTM, Fermentas, США; IPTG: AG, Хеликон, Россия; Сахароза:Panreac, Испания; ЭДТА: >99.0%, AppliChem, Германия; Бутил-тойоперл 650 M: Toyo Soda,Япония; Глицерин: >99.0%, Panreac, Испания; Маркер молекулярного веса белков: 19118кДа, Prestained Protein Molecular Weight Marker, Fermentas, США; Акриламид: SG, Extrapure, Хеликон, Россия; Бис-акриамид: UPG, EP, Хеликон, Россия; Аммония персульфат: ACS,Хеликон, Россия; TEMED: >99%, Хеликон, Россия; бета-меркаптоэтанол: BG, >99.0%,Хеликон, Россия; Бромфеноловый синий: ACS, Хеликон, Россия; Кумасси бриллиантовый70синий G250: UPG, Хеликон, Россия; Трифторуксусная кислота: 99%, EP, Acros Organics,США.Реактивы для кинетики: м-карбокси-п-нитроанилид ФУК (NIPAB): >98%, Sigma,США; Бура: ХЧ, Химмед, Россия; CAPS: Sigma, США; ОФА: Koch Light, Великобритания;ФМСФ: BG, Merсk, США; 6-АПК, 7-АДЦК, ампициллин, амоксициллин, цефалексин, DФГА, D-ФГ, п-ОН-D-ФГА, п-ОН-D-ФГ, п-ОН-D-ФГM, D-ФГ-Глицин, R-NMC: ХЧ,предоставлены лабораторией ферментативной модификации физиологически активныхсоединений, НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского.Реактивы общего назначения: Трис-HCl: >99.0%, Panreac, Испания; Аммониясульфат: ХЧ, Диаэм, Россия; Калий фосфорнокислый однозамещенный: ЧДА, Химмед,Россия; Калий фосфорнокислый двузамещенный: ЧДА, Химмед, Россия; Азид натрия:>99.0%, Acros Organics, США; SDS: BG, >99.5% Amersco, США; Спирт изопропиловый:ОСЧ, Экос-1, Россия; Спирт метиловый: LC, J.T.Baker, Нидерланды; Спирт этиловый: 9596%, ректификат, Россия; Соляная кислота: ОСЧ., Сигма-Тек, Россия; Натрий едкий: ЧДА,Химмед, Россия; Кислота уксусная, ледяная: ХЧ, Химмед, Россия; Ацетонитрил: Сорт 1,Криохром, Россия.Аббревиатуры: BG – Biotechnology Grade, TCG – Tissue Culture Grade,B –Bacteriological, AG – Analytical Grade, SG – Standard Grade, EP – Extra Pure, UPG - Ultra PureGrade, ACS - American Chemical Society Grade, LC – HPLC Gradient Grade.* Также нами были протестированы аптечные препараты, содержащие в своей основехлорамфеникол: Левомицетин таблетированный (ОАО «Фармстандарт – Томскхимфарм»),Раствор левомицетина спиртовой 3% (ОАО «Тверская фармацевтическая фабрика»), Растворлевомицетина спиртовой 3% (ОАО «Ивановская фармацевтическая фабрика».

При сравненииданных препаратов на предмет роста культуры E.сoli на агаризованной среде с добавлениемантибиотика было обнаружено, что препарат Ивановской фабрики не пригоден дляиспользования.Перечень используемого оборудования приведен ниже.Оборудование для молекулярной биологии: Качалка термостатируемая: Excella F24R,New Brunswick, США; Автоклав: Tuttnauer 2540 MK, Израиль; Центрифуга рефрижераторная:715810R, Eppendorf, Германия; Ламинарный шкаф: Nu 440-400E, NuAire, США; ПЦРамплификатор:MasterCyclerpersonal,Eppendorf,Германия;Холодильникнизкотемпературный: GFL-6485, GFL, Германия; Хроматографическая система для очисткибелков: Pharmacia Biotech, Швеция; Трансиллюминатор: Benchtop 3-UV Transilluminator,UVP, США/Англия; Ячейка для концентрирования: M-3, Amicon, США; Термостаттвердотельный: ТТ1 Гном, НПО ДНК-Технологии, Россия; Камера для горизонтальногоэлектрофореза: Mini-Sub cell GT, Biorad, США; Камера для вертикального электрофореза вПААГ: Mini-Protean TETRA, Biorad, США; Источник питания: Эльф-4, НПО ДНКТехнологии, Россия; Насос перистальтический: Miniplus 2, Gilson, Франция.Оборудование для анализа: Жидкостной хроматограф высокого давления: Series 200,Perkin Elmer, США; Спектрофотометр: UV-1601, Shimadzu, Япония.Оборудование общего назначения: Центрифуга: Minispin plus, Eppendorf, Германия;Сухожаровой шкаф: MOV-112, Sanyo, Япония; Холодильник бытовой: XM-6026, Атлант,Беларусь; Холодильный шкаф: ШВ-0.4-20, Атлант, Беларусь; Весы лабораторные до 50 г: LA60, Acculab, Германия; Весы лабораторные до 200 г: PM-200, Mettler, Швейцария; Термостатводный: TM-2.02, Elmi, Латвия; Мультивортекс: V-32, Biosan, Латвия; Шейкер: Multi Bio 3D,Biosan, Латвия; Магнитная мешалка с подогревом: Mr 3001, Heidolpf, Германия; pH-метр:Эксперт 001, Эконикс-Эксперт, Россия; Микроволновая печь: NN S554MF, Panasonic, Китай.722.2 Методы2.2.1 QuikChange ПЦР мутагенезПроведение полимеразной цепной реакции [111; 112].Лиофилизат праймеров растворяли в MQ воде до концентрации 100 мкМ и нагревалив течение 5 мин при температуре 95°С для разрушения вторичных структур.

Затем по 1 мклсоответствующих праймеров в концентрации 2 мкМ добавляли к раствору «ПЦР-премикса»,содержащему 1 мкл плазмиды, взятой в концентрации 20 нг/мкл, 5 мкл 2 мМ dNTP, 5 мкл 10кратного полимеразного буфера и 36,5 мкл MQ воды. После чего в реакционную смесьдобавляли 0,5 мкл смеси высокоточных ДНК-полимераз (High Fidelity PCR Enzyme Mix,Fermentas) в концентрации 2,5 ед. Все операции осуществляли на холоду. АпмлификациюДНК проводили при использовании программируемого термостата (Mastercycler, Eppendorf,Germany) по следующей программе:1 цикл: 3 мин при 95°С16 циклов: 0,5 мин при 95°С, 0,75 мин при 60°С, 12 мин при 72°С1 цикл: 5 мин при 72°СДля получения двойных мутантов готовили ПЦР-смеси для каждой из двух парпраймеров, как описано выше, в объеме 25 мкл, добавляли 0,25 мкл смеси высокоточныхДНК-полимераз в концентрации 2,5 ед. и проводили 4 цикла нагревания – охлаждения поаналогичной программе.