Коллоидно-химические свойства смесей лизоцим-ПАВ в системе водный раствор-октан, страница 12

18). Рост адсорбцииLz происходит при такой же концентрации DTAB, при которой наблюдается увеличение коэффициента распределения лизоцима (рис. 14а). Затем, в области концентраций DTAB 10-6 – 10-5 М происходит снижение величин адсорбции до постоянного значения ≈ 8·10-9 моль/м2, что соответствует адсорбции индивидуального лизоцима. При дальнейшем увеличении концентрации DTAB происходитснижение адсорбции Lz до значения ≈ 2·10-9 моль/м2, т.е.

даже при большом избытке DTAB белок присутствует на поверхности. Для смеси Lz – DTAB с концентрацией белка 0,1 г/л адсорбция лизоцима в диапазоне концентраций ПАВ 10-6 –10-4 М в 4 раза выше, чем у индивидуального белка. Рост адсорбции коррелируетс увеличением растворимости Lz в октане. При больших концентрациях ПАВ адсорбция снижается.На рисунках 14, 16, 17, 18 и далее по оси абсцисс отложена общая концентрация ПАВ C, поскольку уменьшение концентрации в водном растворе вследствие перехода веществ в органическую фазу и их адсорбции на межфазной поверхности не превышало, как правило, 5% (см.

приложения 1, 2). Соответственно,64в масштабах шкалы концентраций отличие C от равновесной концентрации Cwпренебрежимо мало.Рис. 18. Зависимость адсорбции лизоцима из смеси Lz – DTAB с концентрацией белка 0,01 г/л(а) и 0,1 г/л (б) от концентрации DTAB. Пунктирные линии – адсорбция индивидуального Lz.Адсорбция лизоцима из смеси с SDS (концентрация Lz 0,01 г/л) в областиконцентраций ПАВ 10-7 – 10-4 М на 50% выше, чем адсорбция индивидуальноголизоцима. При увеличении концентрации SDS свыше 10-4 М происходит снижение адсорбции белка до конечного значения ≈ 2·10-9моль/м2 (рис.

19).65Рис. 19. Зависимость адсорбции лизоцима из смеси Lz – SDS с концентрацией белка 0,01 г/л (а)и 0,1 г/л (б) от концентрации SDS. Пунктирные линии – адсорбция индивидуального Lz.Адсорбция лизоцима из бинарных растворов с SDS при концентрации белка0,1 г/л в области концентраций SDS 10-6 – 10-4 превышает адсорбцию индивидуального белка в 8 раз. Адсорбция Lz достигает величины, превышающей максимальную адсорбцию при формировании насыщенного монослоя из вертикальноориентарованных глобул. По-видимому, в данной системе образуются полимолекулярные слои. Дальнейшее увеличение концентрации ПАВ приводит к снижению адсорбции белка.Во второй серии экспериментов по изучению адсорбции методом сцинтиллирующей фазы тритиевую метку содержали молекулы ПАВ.

Адсорбция индивидуальных ПАВ с ростом концентрации увеличивается, достигает постоянной величины, а затем снова возрастает при концентрации DTAB свыше 10-3 М и SDSболее 2·10-4 М. Рост адсорбции при высоких концентрациях ПАВ, фиксируемый66методом сцинтиллирующей фазы, может быть связан с образованием предмицеллярных агрегатов и мицелл и солюбилизацией в них органического сцинтиллятора. В дальнейшем проводили анализ адсорбции ПАВ в области формированиямономолекулярного слоя.В системe Lz – DTAB при концентрации лизоцима 0,01 г/л присутствие белка практически не влияет на адсорбцию ПАВ (рис.

20а). При концентрации белкав смеси 0,1 г/л адсорбция DTAB возрастает при концентрации ПАВ выше 10-4 М.Рост адсорбции DTAB наблюдается при той же концентрации, при которой адсорбция лизоцима снижается (рис. 18б). Происходит вытеснение Lz из адсорбционного слоя как за счет конкурентной адсорбции с DTAB, так и за счет гидрофилизации комплекса Lz – DTAB, происходящей при взаимодействии ПАВ с белкомпо механизму гидрофобного связывания.

Снижение адсорбции до величин, превышающих адсорбцию индивидуального белка, указывает на незначительнуюгидрофилизоцию лизоцима.Добавки Lz к раствору SDS слабо влияют на адсорбцию ПАВ при концентрации ниже 3·10-5 М (рис. 20б). При более высоких концентрациях ПАВ адсорбция SDS из бинарного раствора превышает адсорбцию индивидуального ПАВ.Поскольку уменьшение адсорбции лизоцима происходит только при концентрации SDS выше 10-4 М, то в диапазоне концентраций 3·10-5 – 10-4 М наблюдаетсясинергетический эффект при адсорбции: адсорбция и Lz, и SDS превышает соответствующую величину для индивидуальных веществ.67Рис. 20.

Изотерма адсорбции DTAB(а) и SDS (б) из индивидуального раствора (♦) и из смеси слизоцимом с концентрацией Lz 0,01 г/л (♦) и 0,1 г/л (▲).При добавлении как катионного, так и анионного ПАВ к раствору Lz, в области низких концентраций (до 10-6 М) происходит увеличение величин адсорбции (рис. 18, 19) и коэффициентов распределения белка (рис. 14). Полученные результаты указывают на формирование гидрофобного комплекса, растворимостькоторого в органической фазе и адсорбция на межфазной поверхности выше, чему индивидуального Lz.Формирование гидрофобного комплекса Lz – DTAB может происходитьследующим образом.

Молекула белка содержит в своей структуре кислотные иосновные фрагменты, которые в водных растворах при pH близких к нейтральным могут иметь отрицательный и положительный заряд соответственно. На рис.21а представлено распределение заряда по поверхности лизоцима согласно [41], ана рис. 21б показано расположение COOH и NH2-групп в глобуле лизоцима, основанное на пространственных координатах аминокислот, полученных из базы68данных белков (PDB код: 2LYZ, [210]). В результате доступности и кислотных, иосновных групп, как катионное, так и анионное ПАВ имеют возможность взаимодействовать с лизоцимом за счет электростатического притяжения полярныхгрупп.Рис.

21. Пространственное распределение зарядов по поверхности макромолекулы лизоцима (а)[41], а также пространственное расположение COOH и NH2-групп в молекуле лизоцима (б).Как уже отмечалось ранее, глобула лизоцима в водных растворах при pHниже изоэлектрической точки (pI = 11) заряжена положительно.

Однако следуетотметить, что все эксперименты в данной работе проводили в солевом фосфатномбуфере с ионной силой 0,15 М, которая соответствует физиологическому раствору и создается за счет добавления NaCl. Хлорид ионы, находящиеся в большомизбытке, способны адсорбироваться на поверхности белка, вызывая её перезарядку. Измеренные нами величины электрофоретической подвижности лизоцима((–0,32±0,06)∙10-8 м2/(В∙с)) и электрокинетического потенциала (–4,31±0,03 мВ)показали отрицательные значения. Полученный результат согласуется и с литературными данными [47 – 49]: в [48] отмечалось изменение электрофоретическойподвижности белка с +0,15∙10-8 м2/(В∙с) в водном растворе до –0,2∙10-8 м2/(В∙с) приувеличении концентрации NaCl до 0,15 М (рис.

22).69Рис. 22. Электрофоретическая подвижность лизоцима в зависимости от концентрации соли [48].Соответственно, возможно электростатическое притяжение между поверхностно-активным катионом и белком. Получено, что добавки DTAB не влияют назначение ζ-потенциала лизоцима во всем изученном диапазоне концентраций:ζ-потенциал составляет –4,37±0,04 мВ. Это возможно, если совместно с DTA+внутрь границы скольжения входят противоионы. В изученной системе концентрация NaCl существенно превышает концентрацию DTAB, поэтому в качествепротивоионов могут выступать не только Br–, но и Cl–. При взаимодействии полярной группы DTAB c Lz углеводородные цепи ПАВ обращаются в сторонуводного раствора, в результате чего образуется комплекс белок – ПАВ более гидрофобный, чем нативный белок.В системах Lz – SDS ζ-потенциал частиц составляет –4,71±0,03 мВ при всехконцентрациях ПАВ.

Рост гидрофобности лизоцима при сохранении ζ-потенциаламожет происходить в результате замещения хлорид-анионов в двойном электрическом слое на анионы додецилсульфата.Увеличение концентрации ПАВ в водном растворе приводит к снижениюадсорбции и коэффициента распределения лизоцима до значений, соответствующих индивидуальному белку. Полученные результаты могут быть связаны с гидрофилизцией комплекса Lz – ПАВ при взаимодействии белка и ПАВ по механизму гидрофобного связывания.В системе Lz – DTAB гидрофилизация начинается при мольном соотношении DTAB:Lz в водной фазе 1:1 в разбавленном растворе белка (СLz = 0,01 г/л) и70при соотношении DTAB:Lz = 10:1 в более концентрированномрастворе(СLz = 0,1 г/л).

При этом соотношение DTAB:Lz в адсорбционном слое в обоихслучаях близко к 10:1, поэтому можно предположить, что состав гидрофобногокомплекса соответствует стехиометрии DTAB:Lz = 10:1.В системе Lz – SDS уменьшение адсорбции лизоцима происходит при концентрации SDS 10-4 М, что соответствует мольному соотношению SDS:Lz в водном растворе 140:1 (СLz = 0,01 г/л) и 14:1 (СLz = 0,1 г/л). При этом адсорбционныеслои обогащены молекулами ПАВ: мольное соотношение SDS:Lz в слое ≈ 300:1(СLz =0,01 г/л) и 30:1 (СLz =0,1 г/л).Данные метода сцинтиллирующей фазы позволяют изучить зависимостьсостава адсорбционного слоя от состава раствора (рис.

23). Определены мольныедоли ПАВ в смеси в адсорбционном слое XS в зависимости от мольной доли ПАВв смеси в водном растворе XV. Найдено, что межфазные слои обогащены молекулами ПАВ во всем изученном диапазоне концентраций. Даже при СПАВ < CLz слоиформируются с избыточным содержанием ПАВ по отношению к белку. С ростомконцентрации лизоцима мольная доля DTAB в смеси в адсорбционном слоеуменьшается, а SDS – не меняется. Для смеси Lz – SDS изменение XV от 0,5 до 0,9не влияет на состав адсорбционного слоя: XS = 0,9, что соответствует мольномусоотношению SDS:Lz = 9:1.Рис.

23. Зависимость состава адсорбционного слоя смеси Lz – DTAB (а) и Lz – SDS (б) с концентрацией Lz 0,01 г/л (♦) и 0,1 г/л (▲) от состава раствора.71В системе Lz – CAPB при добавлении ПАВ к раствору лизоцима, адсорбциябелка практически не меняется (в пределах ошибки эксперимента). Лизоцим сохраняет свое присутствие в адсорбционном слое даже при многократном избыткеПАВ в растворе (рис. 24).Рис. 24. Зависимость адсорбции лизоцима из смеси Lz – САРВ с концентрацией белка 0,01 г/л(а) и 0,1 г/л (б) от концентрации САРВ. Пунктирные линии – адсорбция индивидуального Lz.Обращает на себя внимание большой разброс данных по коэффициентамраспределения и адсорбции Lz при добавлении САРВ. Это не является ошибкойметода, поскольку при добавлении других ПАВ (DTAB и SDS) воспроизводимость данных оставалась высокой.

Большой разброс можно объяснить особенностями САРВ, который не является индивидуальным веществом, а представляетсобой смесь гомологов. Как известно, интенсивность гидрофобных взаимодействий сильно зависит от длины цепи ПАВ, чем длиннее цепь, тем при меньшихконцентрациях начинается агрегирование. Поэтому в растворе возможно одновременное образование как гидрофобных агрегатов (взаимодействующих по полярным группам), так и гидрофильных (взаимодействующих по механизму гидрофобного связывания). Такие процессы агрегирования по-разному влияют на величину коэффициента распределения белка между водной и органической фазамии его адсорбцию. Но в среднем, хотя и с большой погрешностью, получено, чтораспределение и адсорбция белка практически не меняются в присутствии ПАВ.72Адсорбция САРВ на границе вода/октан с ростом концентрации ПАВ сначала растет, при концентрации 5∙10-5 М достигает постоянного значения примерно1,5 мкмоль/м2 и при концентрации 4∙10-4 М происходит дальнейшее увеличениеадсорбции (рис.