Коллоидно-химические свойства смесей лизоцим-ПАВ в системе водный раствор-октан

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТимени М.В.ЛомоносоваХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТНа правах рукописиИВАНОВ РОМАН АЛЕКСАНДРОВИЧКОЛЛОИДНО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СМЕСЕЙЛИЗОЦИМ ‒ ПАВ В СИСТЕМЕ ВОДНЫЙ РАСТВОР/ОКТАНДиссертацияна соискание ученой степени кандидата химических наукпо специальности 02.00.11 – коллоидная химияНаучный руководитель:к.х.н. Соболева Оксана АнатольевнаМОСКВА - 20142ОглавлениеВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 3I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................ 61.1 Взаимодействие белков с поверхностно-активными веществами в водныхрастворах .......................................................................................................................... 71.2.

Поверхностное натяжение и адсорбция смесей белок – ПАВ .......................... 191.3. Использование метода радиоактивных индикаторов для изучения адсорбциибелков и ПАВ ................................................................................................................. 311.4. Стабилизация эмульсий, пен и пенных пленок смесями белок – ПАВ. ........... 36II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ........................................................................ 402.1. Объекты исследования .......................................................................................... 412.2.

Методы исследования ............................................................................................ 442.2.1. Метод сцинтиллирующей фазы......................................................................... 442.2.2. Метод висящей капли .........................................................................................

512.2.3. Определение размера частиц и электрокинетического потенциала .............. 522.2.4. Получение спектров поглощения в УФ области ............................................. 532.2.5. Метод флуоресценции ........................................................................................ 542.2.6. Ферментативная активность лизоцима в присутствии ПАВ .......................... 552.2.7. Избирательное смачивание ................................................................................ 56III. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. ...................................

583.1. Взаимное влияние лизоцима и ПАВ на распределение в системе вода/октан 583.2. Адсорбция смесей лизоцим – ПАВ на границе вода/октан ............................... 633.3. Поверхностное натяжение смесей лизоцим – ПАВ............................................ 733.4. Определение констант взаимодействия белок – ПАВ в адсорбционных слояхпо модели Файнермана ................................................................................................. 843.4.

Определение размера частиц ................................................................................ 883.6. Изучение взаимодействия Lz – ПАВ методом флуоресценции ........................ 933.7. Ферментативная активность лизоцима в присутствии ПАВ ............................. 953.8. Избирательное смачивание в системе водный раствор смесиLz ─ ПАВ/октан/гидрофобизованное стекло ...........................................................

1013.9. Адсорбция и распределение смесей лизоцим – ПАВ в системе вода/октан. . 104ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ .............................................................. 110СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................... 111ПРИЛОЖЕНИЯ. .......................................................................................................... 1283ВВЕДЕНИЕАктуальность темы.

Изучение адсорбции глобулярных белков на границахраздела фаз водный раствор/органическая жидкость в присутствии ПАВ актуально с точки зрения понимания ряда биологических процессов, происходящих вклеточных мембранах, и развития новых биохимических технологий в различныхобластях [1, 2]. Интерес к изучению смесей белок – ПАВ связан с широким использованием таких композиций при создании лекарственных препаратов, моющих средств, эмульсий в пищевой, косметической и фармацевтической промышленности. Большинство результатов, полученных в последнее время, относится кизучению водных растворов смесей белок – ПАВ или их адсорбции на границеводный раствор/воздух.

Система усложняется, если водная фаза граничит с органической, так как оба компонента смесей и их комплексы могут не только адсорбироваться на межфазной поверхности, но и переходить в органическую фазу.Такие двухфазные системы ближе к условиям протекания биологических процессов в живых организмах, а также к условиям ряда технологических процессов.Слабая изученность поведения смесей белок – ПАВ в системе водный раствор/органическая жидкость объясняется ограниченным набором экспериментальных методик, позволяющих получать достоверные данные об адсорбции намежфазной границе. Использование в данной работе метода сцинтиллирующейфазы с меченными тритием веществами открывает широкую перспективу получения надежных данных об адсорбции, распределении веществ в системе и, главное,о взаимном влиянии белка и ПАВ на эти свойства. Развитый в диссертации подход к изучению бинарных смесей, в котором тритиевую метку содержит поочередно один из компонентов смеси, дает информацию о взаимном влиянии веществ на их адсорбцию, распределение, состав адсорбционного слоя в широкойобласти концентраций, включая область низких концентраций, в которой другиеметоды не работают.

В последнее время разработаны методики получения, выделения и идентификации меченных тритием органических веществ различногостроения [3 – 5] , что позволило исследовать смеси глобулярного белка лизоцима4(Lz) не только с традиционными ПАВ - бромидом додецилтриметиламмония(DТАВ) и додецилсульфатом натрия (SDS), но и с цвиттерионным ПАВ кокоамидопропил бетаином (САРВ), который в последнее время широко используется вкачестве соПАВ при создании различных композиций в косметической промышленности и моющих средствах [1, 6, 7].

Сочетание методов сцинтиллирующей фазы и межфазной тензиометрии позволило впервые показать, как взаимодействиямежду белком и ПАВ разной природы влияют на коллоидно-химические свойствадвухфазных систем водный раствор/органическая жидкость.Цель работы: установить механизмы адсорбции и распределения смесей лизоцимаи ПАВ различной природы в системе двух несмешивающихся жидкостей. Установить влияние взаимодействия белка и ПАВ на коллоидно-химические свойствасистем водный раствор смеси Lz – ПАВ/октан.Для достижения поставленной цели в диссертации решались следующиезадачи:- методом сцинтиллирующей фазы определить коэффициенты распределения ивеличины адсорбции лизоцима и ПАВ на границе вода/октан, установить составадсорбционных слоев;- разработать методику получения меченного тритием цвиттерионного ПАВ кокоамидопропил бетаина;- изучить взаимное влияние белка и ПАВ на межфазное натяжение;- определить размер и структуру агрегатов белок – ПАВ;- исследовать ферментативную активность лизоцима в присутствии ПАВ;- оценить устойчивость смачивающих пленок, стабилизированных смесями лизоцим – ПАВ.Научная новизна.

Разработанный в диссертации подход, основанный на сочетании методов сцинтиллирующей фазы и межфазной тензиометрии, позволил получить уникальные данные о взаимном влиянии лизоцима и ПАВ на адсорбцию награнице водный раствор/октан, на распределение в двухфазной системе, определить состав смешанных адсорбционных слоев Lz с ПАВ различного типа (анионного, катионного и, впервые, цвиттерионного) в широкой области концентраций.5На основании сопоставления данных методов сцинтиллирующей фазы, тензиометрии, статического и динамического светорассеяния, флюоресценции, определения ферментативной активности установлены основные стадии перераспределения компонентов между контактирующими фазами и межфазным адсорбционным слоем.

Выявлены области концентраций, при которых формируются гидрофобный и гидрофильный комплексы белок – ПАВ, установлена их локализация ивлияние на межфазное натяжение, ферментативную активность, устойчивостьсмачивающих пленок.Практическая значимость. Выявленные закономерности адсорбции глобулярных белков в присутствии других веществ на границе жидкость/жидкость могут способствовать пониманию функционирования белков в живых организмах, атакже быть использованы для развития новых биохимических технологий.

Данные о влиянии ПАВ на ферментативную активность Lz позволяют оптимизировать состав композиций, использующихся для создания дисперсных систем, стабилизированных смесями белок – ПАВ.Полученные закономерности поведения смесей белок – ПАВ в системе водный раствор/органическая жидкость могут быть использованы в спецкурсах длястудентов и аспирантов, специализирующихся в области коллоидной химии, биохимии, биотехнологии.6I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫСписок сокращений, используемых в обзоре литературы.Белки и биополимеры:β-Cs – β-казеин,β-LG – β-лактоглобулин,BSA – бычий сывороточный альбумин,Gn – желатин,HFB – гидрофобин,HSA – сывороточный альбумин человека,Lz – лизоцим,OVA – овальбумин,OVT – овотрансферин,RM – липаза rhizomucor mieihei,WPI – изолят сывороточного протеина.Поверхностно-активные вещества:AOT – бис(2-этилгексил)сульфосукцинат натрия,C10DMPO – децилдиметилфосфин оксид,C12DMPO – додецилдиметилфосфин оксид,С12Е5 – додециловый эфир пентаэтиленгликоля,С12Е6 – додециловый эфир гексаэтиленгликоля,C12E8 – додециловый эфир октаэтиленгликоля,CTAB – бромид гексадецилтриметиламмония,DTAB – бромид додецилтриметиламмония,SDBS – додецилбензолсульфоната натрия,SDS – додецилсульфат натрия,SOS – октилсульфат натрия,Span 20 – сорбитан монолаурат,TTAB – бромид тетрадецилтриметиламмония,Tween 20 – полиоксиэтилен сорбитан монолаурат,Tween 80 – полиоксиэтилен сорбитан олеат,Тритон Х-100 – п-третоктилфениловый эфир полиоксиэтиленгликоля.71.1 Взаимодействие белков с поверхностно-активными веществами в водныхрастворахМеханизмы взаимодействия низкомолекулярных ПАВ с белками достаточно сложны, сильно зависят от ряда параметров, таких как аминокислотный составбелков, рН, электролитный состав раствора, третичная структура белка, наличиезарядов на поверхности, количество и относительное расположение гидрофобныхи гидрофильных участков на макромолекуле белка.

Как известно, трехмернаяупаковка мономеров в макромолекуле белка такова, что гидрофобные и гидрофильные аминокислотные остатки в значительной степени сегрегированны: внутренняя часть молекул глобулярных белков преимущественно гидрофобна, а поверхность молекулы белка – гидрофильна с небольшими гидрофобными доменами. ПАВ способны связываться как с полярными, так и с гидрофобными доменами белков. Важнейшими вопросами, связанными с взаимодействием белков иПАВ, являются: обратимость связывания, идентификация центров связывания,определение влияния взаимодействия на поведение смесей на поверхности, изучение стабилизирующего действия по отношению к различным системам (пенам,эмульсиям, суспензиям), денатурация белка в присутствии ПАВ. Несмотря на всюважность этих вопросов, системы, включающие белок и ПАВ, остаются мало исследованными, и до сих пор нет общепринятых количественных моделей для ихописания [1, 2, 8].Наиболее часто встречающейся моделью комплекса белок – ПАВ являетсямодель «ожерелье и бусинки».