Коллоидно-химические свойства смесей лизоцим-ПАВ в системе водный раствор-октан, страница 10

В результате были получены меченный тритием лизоцим с молярной радиоактивностью 5,4 ТБк/моль и меченые DTAB и SDS с удельной радиоактивность 3,2 и 30,0 ТБк/моль соответственно. Величина радиоактивности меченых веществ такова, что позволяет фиксировать их содержание в органической фазе вплоть до концентрации 10-11 М. При исследовании поведения индивидуальных веществ водная фаза представляла собой растворы ПАВ или белкас удельной радиоактивностью 74 кБк/мл. Для приготовления растворов с указанной радиоактивностью смешивались водные растворы меченого тритием и немеченого вещества.Методика введения тритиевой метки в САРВ была разработана в рамках настоящей работы.

Для получения меченного тритием CAPB его водный растворнаносили на стенки специального реактора при непрерывном вращении, после чего его замораживали в жидком азоте. Далее камеру заполняли газообразным тритием до давления 0,5 Па и проводили процесс мечения при распаде молекул три-48тия на атомы на вольфрамовой нити при температуре 1900 К в течение 10 с. Процесс введения тритиевой метки заключается в неспецифическом замещении доступных для атаки атомов водорода молекул мишени на тритий. Для удаления трития из лабильных положений проводили несколько раз растворение полученноговещества в воде и удаление воды на роторном испарителе. Анализ чистоты полученного CAPB проводили с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках Silica Gel 60 (Sigma Aldrich) в системе бутанол/уксусная кислота/вода в объемном соотношении 3:1:1.

Для проведения хроматографического исследованиявещество растворяли в воде до концентрации 0,1 М и каплю полученного раствора наносили на хроматографическую пластику. Одновременно с меченым препаратом на той же пластине проводили хроматографию исходного САРВ. Положение немеченого вещества на пластинке определяли с помощью реактива Драгендорфа [201], образующего окрашенный комплекс с четвертичной аммониевойгруппой. Реактив Драгендорфа получали при смешивании 4 мл 1,4% раствораBi(NO3)3 в 20% уксусной кислоте, 1 мл 30% раствора KI и 20 мл дистиллированной воды.

Распределение по пластине меченного тритием образца определяли спомощью сканера радиоактивности Бетахром (Россия). Результат сканированияпредставлен на рис. 7а. Красной пунктирной линией обозначено положение напластине исходного САРВ. На фронте пластинки был получен максимум дляпримесей, которые удаляли с помощью экстракции.49Рис. 7. Распределение радиоактивности на хроматографической пластинке водного раствораСАРВ после удаления лабильной метки (а) и после восьмой экстракции в гептан: водного раствора (б) и органической фазы (в).50Экстракцию проводили в системе водный раствор/гептан в объемном соотношении 1:10 до постоянства радиоактивности отобранной из гептана аликвоты(8 раз), т.е. до тех пор, пока не устанавливалось постоянное значение коэффициента распределения САРВ (рис.

8). Затем водный раствор и органическую фазувновь подвергли хроматографическому анализу (рис. 7 б, в).Как видно из результатов сканирования, практически полностью удалосьизбавиться от пика примесей на границе фронта для водного раствора. Все примеси перешли в органическую фазу (синие пунктирные линии). Радиохимическаячистота полученного меченого CAPB составляет 95%, молярная радиоактивность23,3 ТБк/моль.Рис. 8.

Изменение радиоактивности гептана при экстракции 3Н-САРВ.При исследовании смесей Lz – ПАВ были выполнены две серии экспериментов, в каждой из которых тритиевая метка находилась только в одном из компонентов смеси. Постановка эксперимента позволяла изучить взаимное влияниекомпонентов смеси на распределение между фазами и адсорбцию, рассчитатьсуммарную адсорбцию и определить состав адсорбционного слоя.

Каждый эксперимент воспроизводили 3 – 5 раз.512.2.2. Метод висящей каплиМежфазное натяжение растворов индивидуальных веществ и смесей лизоцим – ПАВ на границе водный раствор/октан и раствор/воздух измеряли методомвисящей капли. В исследуемых системах установление равновесной адсорбцииПАВ и, особенно, белка требует определенного времени, связанного как с диффузией веществ к межфазной поверхности, так и с их переориентацией в поверхностном слое. Метод висящей капли является статическим, позволяет варьироватьвремя формирования межфазной поверхности в широких пределах и тем самымизмерять поверхностное натяжение в равновесных условиях.Суть метода висящей капли состоит в том, что при помещении капли в среду с плотностью, отличной от плотности жидкости в капле, под действием гравитационных и капиллярных сил будет происходить изменение её формы.

Висящаякапля деформируется до тех пор, пока гидростатическое давление не уравнове 11  . Здесь Δρ – разность плотностей жидко r1 ( z ) r2 ( z ) сится капиллярным: gz   сти в капле и в окружающей среде (принимали плотность водных растворов 1,000г/см3, октана 0,702 г/см3, воздуха 0 г/см3), r1(z) и r2(z) – главные радиусы кривизныповерхности капли на уровне z. Для измерения поверхностного натяжения формировали с помощью дозатора каплю исследуемого раствора в стеклянной кювете, на дно которой был помещен исследуемый раствор (с целью предотвращенияиспарения капли).

Затем каплю фотографировали при помощи горизонтальногомикроскопа, оборудованного цифровой видеокамерой DCM-130 (рис. 9).Рис. 9. Видеоизображение капли водного раствора лизоцима (С = 7·10-8 М) в среде октана.52Межфазное натяжение рассчитывали с помощью программного пакетаDrop Shape Analysis (Kruss) по профилю капли методом численного интегрирования уравнения Юнга-Лапласа и приближением рассчитанного профиля капли кполученному экспериментально.Перед проведением измерений межфазного натяжения на границе водныйраствор/октан в стеклянную кювету с пробкой помещали 1 мл исследуемого водного раствора и 2 мл октана и оставляли двухфазную систему на двое суток прикомнатной температуре для взаимного насыщения фаз.

Затем проводили измерения, используя взаимно насыщенные растворы. Каплю водного раствора формировали в среде октана и выдерживали до тех пор, пока межфазное натяжение непереставало меняться. Постоянное значение достигалось в течение 30 минут длярастворов индивидуальных ПАВ и в течение 60 минут для растворов смесей белок – ПАВ. Каждое измерение выполняли 3 – 5 раз, погрешность измерения поверхностного натяжения составляла 0,5 – 2,5 мН/м (в зависимости от концентрации раствора).2.2.3. Определение размера частиц и электрокинетического потенциалаИзмерения размера частиц проводили на анализаторе размера частиц ZetaTrak (Microtrac, США). Прибор позволяет измерять размеры частиц в диапазоне0,9 – 6500 нм, т.е. дает обширную информацию об образовании ассоциатов в растворе, денатурации белка, мицеллообразовании и т.д.

В основе метода лежит эффект Доплера, то есть изменение частоты света при отражении от движущихсячастиц. Свет лазера рассеивается на находящихся в броуновском движении частицах. Отраженный под углом 180° свет попадает обратно на детектор. По изменению частоты υ строится распределение количества частиц по скоростям, и определяется длина волны λ, соответствующая максимуму. Связь скорости движения частиц с их радиусом дает теория броуновского движения Эйнштейна-Смолуховского. Диаметр частиц d вычисляется по формуле:(2-9),где η – вязкость, Па·с, k – постоянная Больцмана, Дж/К, Т – температура, К.53Этот же прибор позволяет измерить ζ-потенциал частиц.

Для этого в измерительной ячейке создается постоянное электрическое поле, в результате чего заряженные частицы начинают направленно двигаться к противоположно заряженному электроду. По смещению распределения скоростей определяется электрофоретическая подвижность частиц μ:(2-10),где v – скорость, м/с, Е – напряженность электрического поля, В/м.Электрокинетический потенциал ζ рассчитывается из уравнения Смолуховского:(2-11),где ε – относительная диэлектрическая проницаемость раствора.2.2.4.

Получение спектров поглощения в УФ областиИзмерения проводили в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 смна однолучевом спектрофотометре Agilent 8453 (Agilent Technologies, США). Вкачестве раствора сравнения использовали солевой фосфатный буфер. Спектр поглощения лизоцима (рис.

10) имеет максимум при длине волны 280 нм, что согласуется с литературными данными [22, 202, 203]. Поглощение происходит в ультрафиолетовом диапазоне длин волн, что обусловлено наличием ароматическихфрагментов в аминокислотных остатках (в основном, в триптофане и тирозине).Для исследования светорассеяния в водных растворах Lz – ПАВ, определяли зависимость оптической плотности при 320 нм от состава раствора (в этой областидлин волн отсутствует поглощение, и рост оптической плотности связан только сосветорассеянием).54Рис.

10. Спектр поглощения лизоцима (концентрация 1 г/л).2.2.5. Метод флуоресценцииМетод флуоресценции дает информацию о микрополярности окруженияфлуорофорных групп (в случае лизоцима – триптофан 62 и 108 [41]), что позволяет делать выводы о взаимодействии белка с ПАВ. Эксперимент проводили наспектрофлуориметре FluoroMax-3 (Horiba Jobin Yvon, Франция) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см. При возбуждении УФ-светом с длинойволны 280 нм получали спектры эмиссии в области 300 – 400 нм. Время измерения одной точки – 0,5 с. Спектр флуоресценции лизоцима представлен на рис.11.Рис.11. Спектр флуоресценции лизоцима (концентрация 1г/л).55При длине волны 342 нм наблюдается максимум, что согласуется с литературными данными [22, 41, 203 – 205].

При сопоставлении спектров исходного лизоцима и лизоцима в смеси с ПАВ, были получены величины относительнойфлюоресценции в максимуме (за 100% принимали оптическую плотность для индивидуального лизоцима). Чувствительность метода такова, что были изученырастворы, содержащие 1 г/л лизоцима; более разбавленные растворы данным методом исследовать не удалось.2.2.6. Ферментативная активность лизоцима в присутствии ПАВПроведено изучение ферментативной активности Lz в присутствии ПАВ поотношению к грам-положительным бактериальным клеткам Micrococcus luteusтурбидиметрическим методом, описанным в [206 – 208].

Для этого навеску лиофилизованных клеток M.luteus растворяли в буферном растворе, концентрациюполученной суспензии клеток подбирали таким образом, чтобы оптическая плотность суспензии OD при длине волны 650 нм составляла около 0,5. Для измерениясветопоглощениярастворовиспользовалидвухлучевойспектрофотометрUV-1601PC (“Shimadzu”, Япония). Измерения проводили в термостатируемыхмикрокюветах с длиной оптического пути 1 см и объемом 0,5 мл. Температураэксперимента составляла 24о С. К суспензии клеток, помещенных в микрокювету,добавляли раствор смеси Lz – ПАВ определенной концентрации и состава, перемешивали и измеряли зависимость оптической плотности от времени OD(t)(рис. 12). Каждый эксперимент повторяли 3 – 5 раз, погрешность определения AEсоставляла 5 – 30 %.