Исследование структуры гумусовых кислот методами спектроскопии ЯМР 1Н и 13С, страница 20

Затембыстро добавляли 1 мл D2O в прибор для обмена и снова подсоединяли его к вакуумнойустановке для удаления воздуха. В связи с неполным растворением препаратадейтерообмен проводили в течение трех дней в отсутствие доступа воздуха приперемешивании на магнитной мешалке. Затем воду отгоняли на вакуумной установке,сушили образец в течение 6 часов, после чего разбивали ампулу с ДМСО-d6, ипроисходило растворение образца. Раствор переливали в ампулу 3, которую отпаивали ипомещали в трубку 4 с припаянной 5 мм ЯМР-ампулой 5 и шлифом, трубку подсоединяличерез кран к вакуумной установке и откачивали. Затем кран перекрывали, ампулу 4 сраствором ГК разбивали встряхиванием и раствор перетекал в ампулу для ЯМР, которуюпотом отпаивали по перетяжке.Приготовление образцов ГК для регистрации спектров ЯМР в ДМСО-d6в присутствии CF3COODДля регистрации ПМР спектров ГФК в ДМСО-d6 в присутствии CF3COOD ампулу сраствором ГФК в ДМСО вскрывали и микропипеткой добавляли 20 мкл CF3COOD, послечего регистрировали спектр.Приготовление образцов ГК для регистрации спектров ЯМР в 0.1M NaOD/D2OПри регистрации спектров ПМР в NaOD/D2O для уменьшения интенсивностисигнала HDO препараты ГФК подвергали предварительному дейтерообмену.

Для этогонавеску ГФК массой 15 мг помешали в прибор для дейтерообмена 2, предварительновысушенный под вакуумом, туда же помещали разбиваемую ампулу 1 с D2O высокойчистоты. Осушка образцов проводили в течение 6 часов при 45оС на вакуумной установке.Затем быстро добавляли 1 мл D2O и 5 мкл 40% NaOD в прибор для обмена, и сноваподсоединяли его к вакуумной установке для удаления воздуха.

Дейтерообмен проводилив течение 12 часов в отсутствие доступа воздуха. Потом воду отгоняли на вакуумнойустановке и образец сушили в течение 6 часов, после чего разбивали встряхиваниемампулу с D2O высокой чистоты. Раствор сливали в ампулу 3 и ее отпаивали. Ампулу сраствором помещали в трубку 4 с припаянной ЯМР-ампулой 5 и шлифом, трубкуподсоединяли через кран к вакуумной установке и откачивали. Затем кран перекрывали,ампулу с раствором ГК разбивали встряхиванием, и раствор перетекал в ЯМР-ампулу,которую потом отпаивали.12043125Рис. 3.1.

Приборы для приготовления образцов.1. Разбиваемая ампула с растворителем.2. Объем дла проведения реакции.3. Разбиваемые ампулы.4. Стеклянная трубка для разбивания ампулы 3.5. Ампула для ЯМР.1213.3. Методика токсикологических экспериментов.Культивирование тест-объектаВ качестве объекта токсикологических исследований служила культура зеленойводоросли Chlorella vulgaris .Культивированиеинтенсивнойкультурыхлореллы(термофильныйштамм)осуществляли на 20% -ной среде Тамия в термостатируемых культиваторах емкостью 200мл, при температуре 35°С, с продувкой увлажненным воздухом, при освещенности 30Вт/кв.м (люминесцентные лампы типа ЛДЦ-40) и рН 6.6-6.8.

Перед тестированиемводоросли разращивали в течение суток. Начальная плотность посадки - 500 тыс. кл./мл. Кконцу суток плотность клеток была не менее 10 млн. кл./мл.Методика токсикологического экспериментаИнтенсивную культуру хлореллы после суточного выращивания освобождали откультуральной среды и концентрировали центрифугированием в течение 3-х минут прискорости 5000 об./мин. Полученную суспензию водорослей пересеивали на 10% -нуюсреду Тамия, не содержащую фосфатов, ЭДТА и микроэлементов, добавляли токсикантыи гумусовые вещества в требуемых концентрациях. Объем исследуемых проб составлял100 мл, начальная плотность культуры - 500 тыс.

кл./мл. Остальные условия проведенияопытов (освещенность, температура, рН, продувка увлажненным воздухом) были теми же,что и при выращивании культуры.Регистрация тестовых параметровДля оценки состояния водорослей использовали параметры быстрой флуоресценции.Выход быстрой флуоресценции измеряли при помощи 2-х лучевого импульсногофлуориметра. Измерения проводили в момент начала эксперимента, через 2 и через 4 часа.Интенсивность постоянной флуоресценции (Fо), которая отражает излучательные потериэнергии возбуждения при миграции ее к открытым реакционным центрам, измеряли приосвещенииадаптированныхктемнотеобразцовслабымиимпульсамисвета.Интенсивность максимальной флуоресценции (Fm) при восстановленном первичномхинонном акцепторе измеряли аналогичным образом, но при дополнительном облученииобразцов действующим светом в присутствии 10-5 М диурона.

Относительный выходпеременной флуоресценции, характеризующий квантовую эффективность первичнойфотосинтетической реакции, рассчитывали как Fv/Fm, гдеFv = Fm - Fo.У лабораторной культуры хлореллы в оптимальных условиях отношение Fv/Fmобычно составляет 0.75 - 0.80, и снижается при нарушениях фотосинтеза. У мертвыхклеток Fv/Fm = 0.122123ВЫВОДЫ1. Количественно охарактеризован детальный фрагментный состав ГФК вод, почв, торфаи угля.

Определены общие закономерности строения и установлены достоверныеструктурные различия ГФК указанных основных природных источников. Показано, чтов структуре ГФК торфа и почв спиртовые гидроксилы в основном принадлежатполисахаридным фрагментам, а в ГФК пресных вод до 50% этих групп не входит всостав полисахаридов. Показано, что содержание сложноэфирных групп в ГК выше,чем в ФК.2.

Разработана схема расчета детального фрагментного состава ГФК, основанная накомплексном анализе данных 1Н и13С ЯМР спектроскопии. Предложен набор из 12структурных фрагментов, позволяющих детально описать структуру ГФК различногопроисхождения:СС=О, ССООН, ССООR, СArOH, СArOR, СArH, CArC, CO-Alk-O, ССНОН, ССН2ОН, СОСН3, CAlk3. Разработанметодколичественнойхарактеристикираспределенияводородафункциональных групп и углеродного скелета ГФК ïðè ïîìîùè ñïåêòðîñêîïèè 1Í.4. Экспериментально обоснованы оптимальные условия регистрации количественных13СЯМР спектров ГФК.5.

Предложен способ использования данных по фрагментному составу для корректировкирезультатов гель-хроматографического определения молекулярных масс ГФК.6. Установлена взаимосвязь структуры и детоксицирующих свойств ГФК по отношению кCu2+, Cd2+, Pb2+.124ВЫРАЖЕНИЕ ПРИЗНАТЕЛЬНОСТИАвтор выражает глубокую признательность:• Сотрудникам кафедры биофизики Биологического факультета МГУ д.б.н.

МаторинуД.Н., д.б.н. Венедиктову П.С. и к.б.н. Вавилину Д.В. за оказанную помощь ворганизации токсикологических экспериментов.• Сотруднику Института Экологической Химии (IOC), Мюнхен, Германия,Dr. N. Hertkorn за оказанную помощь в постановке двумерных ЯМР экспериментов иобсуждению полученных результатов.• Сотруднику кафедры общего земледелия и охраны почв факультета почвоведенияМГУ к.б.н. Лебедевой Г.Ф. за предоставленные препараты гумусовых кислот почв.А также организациям, оказавшим финансовую поддержку при выполнении даннойработы:• Robert Havemann Scholarship• Российскому Фонду фундаментальных исследований (гранты №96-04-49838 и №98-0333186а),• Госкомитету Российской федерации по высшему образованию (грант в областифундаментальных проблем охраны окружающей среды и экологии №4-26).125СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ1.Кононова М. М.

Органическое вещество почвы. М., Изд-во МГУ, 1963.2.Орлов Д. С. Химия почв. М., Изд-во МГУ, 1992, 259 c.3.Орлов Д. С. Свойства и функции гуминовых веществ. В сб.: Гуминовые вещества вбиосфере. М., Наука, 1993, с. 16-27.4.Rashid M.A. Geochemistry of marine humic compounds. Springer-Verlag, Oxford, 1985,243 p.5.Линник П.Н., Набиванец Б.И. Формы миграции металлов в пресных поверхностныхводах. Гидрометеоиздат. Л., 1986, 268 с.6.Schnitzer M., Khan S.U.

Humic substances in the environment. N.Y., Marcel Decker, 1972,p. 12-17.7.Орлов Д. С. Гумусовые кислоты почв. М., Изд-во МГУ, 1974, 287 с.8.Stevenson F.J.//Geochemistry of Soil Humic Substances. In: Humic substances in soil,sediment and water. Aiken G.R., McKnight D.M., Wershaw R.L., MacCarthy P. (Eds.),N.Y., John Wiley & Sons, 1985, p. 13-52.9.Humic substances and their role in the environment. Rep. of Dahlem workshop, Berlin,1987.

John Wiley & Sons Limited. S. Bernhard. Dahlem Konferenzen. 1988, р. 133-148.10. Bollag J.-M., Mayers K.//Sci. Total Environ., 1992, v. 117/118, p. 357-366.11. Ziechman W.//Huminstoffen. Problemen, Methoden, Ergebniss. Weicheim: Chemie, 1980,480 p.12. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации.Изд-во МГУ, М., 1990, 325 с.13. Нефтепродукты: методы испытаний.

Ч.1.-М., изд. стандартов, 1977, 379 с.14. Coal Science. Corbaty M.L., Larsen J.W., Wender I., Academic Press, N.Y.,15. Кушнарев Д.Ф. Количественная спектроскопия ядерного магнитного резонансаприродного органического сырья и продуктов его переработки. Дисс.

докт. хим.наук. Иркутск, 1997, 267 с.16. Данченко Н.Н. Функциональный состав гумусовых кислот: определение ивзаимосвязь с реакционной способностью. Дисс. канд. хим. наук., Москва, 1997, 138с.17. Huffman E.W.D., Stuber Jr. and H. A. Analytical Methodology for Elemental Analysis ofHumic Substances.

In: Humic substances in soil, sediment and water Aiken G.R.,McKnight D.M., Wershaw R.L., MacCarthy P. (Eds.), John Wiley & Sons. N.Y., 1985, p.433-455.12618. Rice J.A., MacCarthy P.//Org. Geochem., 1991, v. 17, N. 5, p. 635-648.19. Perdue E.M. // Geochim. Cosmochim. Acta. 1984, v. 48, p. 1435-1442.20. Harvey G.R., Boran D.

A., Tokar J.M. // Mar. Chem., 1983, N. 12,p. 119-132.21. Buffle J., Altmann R.S.//Geochem. Cosmochim. Acta, 1988, v. 52,p. 1505-1508.22. Stuermer D. H., Payne J. R.//Geochem. Cosmochim. Acta, 1976, v. 40, p. 1109-1114.23. Wilson M.A., Philip R.P., Gillam A.H., Tate R.R. // Geochim. Cosmochim. Acta, 1983, v.47, p. 497-502.24. Wilson M. A., Gillam A. H., Collin P. J.

// Chem. Geol., 1983, v. 60,N. 3-4, p. 181-201.25. Stuermer D. H., Peters K.E., Kaplan I.R. // Geochim. Cosmochim. Acta. 1978, v. 42, p.989-997.26. Piotrowicz S.R., Harvey G.R., Boran D.A. еt al. // Marine Chem., 1984,v. 14, p. 333-346.27. Van Krevelen D.W. // Fuel, 1950, v. 29, p. 269-284.28. Visser S.A. // Environ. Sci. Technol., 1983, v. 17, N. 7, p. 412-417.29. Abbt-Braun G., Schmiedel U., Frimmel F.H. // Vom Wasser, 1990, B.