Исследование структуры гумусовых кислот методами спектроскопии ЯМР 1Н и 13С, страница 19

Это подтверждает114предположение о высоком вкладе салицильных фрагментов в комплексообразование ГФКс металлами. По-видимому, повышение количества салицилатных фрагментов вмолекулах ГФК вызывает прочное связывание в комплекс и снижает концентрациютоксичной для водоросли свободнорастворенной формы металлов.Таблица 2.13.Коэффициенты корреляции между ДК50 и параметрами структуры ГФК.(COOH+ArOH)*CAr(COOH+ArOH)*CArCSCAlk-OCArДК50(Cu)0.990.930.65ДК50(Cd)0.980.700.94ДК50(Pb)0.990.950.891153. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.3.1. Материалы и оборудование.Растворители для спектроскопии 13С ЯМРВ качестве растворителя для спектроскопии 13С ЯМР приготавливали 0.1 M растворNaOH квалификации ч.д.а. в D2O производства ТОО "Изотоп" изотопной чистоты 99.5%D.В качестве внутреннего стандарта для спектроскопии13С ЯМР использовали DSS(натриевая соль 3-триметилсилил-1-пропан-сульфокислоты).Растворители для спектроскопии ПМРДиметилсульфоксид-d6 производства фирмы “Изотоп” сушили над CaH2 в течение24 ч.

при перемешивании с последующим вакуумным переносом. Затем ДМСО-d6разливали по разбиваемым ампулам в атмосфере азота в количестве, необходимом дляприготовления одного образца для снятия спектра (0.7 мл). Содержание воды проверялипо спектру ПМР, интегральная интенсивность пика воды составлял не более 8 % отинтеграла пика ДМСО. Изотопная чистота ДМСО-d6 составляла 99.5% атомных.Диметилсульфоксид-d6 производства фирмы Merck, в ампулах по0.7 мл, изотопной чистоты 99.95 % атомных, содержал не более 0.02% воды и его осушкане производилась.Дейтероксид, D2Oа)ДляпроведениядейтерообменапрепаратовГФКиспользовалиD2Oпроизводства ТОО "Изотоп" изотопной чистоты 99.5% атомных.б) В качестве растворителя для регистрации ПМР спектров использовали D2Oфирмы Aldrich изотопной чистоты 99.996 атомных %, предварительно расфасованный вразбиваемые ампулы по 0.7 мл на вакуумной установке.Дейтерированный гидроксид натрия, NaOD представлял собой 40% растворNaOD в D20 производства фирмы Aldrich изотопной чистоты 99+ атомных %.Дейтерированная трифторуксусная кислота CF3COOD производства фирмы“Изотоп” изотопной чистотой 98.5 атомных %.В качестве модельных соединений для спектроскопии ПМР использовали 2,4дигидроксибензойную кислоту квалификации "хч" и полидекстран производства фирмы"Polymerservice", ММ=4300 без дополнительной очистки.Для культивирования культуры водоросли Chlorella vulgaris использовали средуТамия, состав которой приведен в табл.

3.1. рН среды Тамия доводили 0.1М КОН (чда) довеличины 6.6 - 6.8.Для проведения токсикологических экспериментов в качестве токсикантовиспользовали CuSO4, CdSO4 и Pb(NO3)2 марки "чда".116Таблица 3.1.Приготовление культивационной среды ТамияКомпонентKNO3MgSO4 *7H2OKH2PO4ЭДТАFeSO4*7H2OH3BO3MnCl2*4H2OZnSO4*4H2OMoO3NH4VO3Концентрация, г/л52.51.250.0373*10-32.76*10-31.81*10-42.24*10-51.75*10-52.3*10-53.2.

Выделение препаратов ГФК.Препараты ГФК речных вод FMX-8 и FIX-8 были выделены сорбцией на смолеАмберлит ХАД-8 из вод р. Москва (район г.Звенигород), и р. Истра (выше Истринскоговодохранилища), соответственно по методике [Данченко,18]. Отфильтрованную иподкисленную концентрированной HCl до рН 2 речную воду пропускали через колонку сосмолой до насыщенно-желтого окрашивания смолы (около 500 л.). Скорость пропусканиясоставляла около 5 л/час.

Затем колонку промывали дистиллированной водой доотрицательной реакции на Сl--ион по 0.1 М AgNO3 и десорбировали ГФК 0.1 М NaOH.Щелочной экстракт обессоливали пропусканием через катионит КУ-2-8 в Н-форме (рНполученных таким образом растворов составил 2.95-3.4). Катионит КУ-2-8 переводили вН-форму пропусканием через колонку 30-кратного по объему количества 1М HCl.Препараты ГФК в твердой форме получали при упаривании обессоленных растворов наротационном испарителе.Использованные в работе препараты ГК и ФК почв, а также препарат HTW былипредоставлены кафедрой общего земледелия и охраны почв факультета ПочвоведенияМГУ.

Препараты ГФК торфа, а также FWME-4, SWM-4 и SEL, были предоставленылабораторией физической органической химии Химического факультета МГУ. ПрепаратыBS1FA, FG1FA и HO10FA были предоставлены кафедрой водной химии Института им.Энглера и Бунте Технического университета Карлсруэ (Германия). В работе также былииспользованы коммерческие препараты ГФК торфа (НПО “Биолар”) и ГК бурых углейпроизводства фирмы Aldrich и АО "Спецбиотех". Препарат ФК морских вод былпредоставлен NAOML (Miami, USA).Полный перечень препаратов ГФК приведен в таблице 2.1.117Для элементного анализа и ЯМР-спектроскопии использовали твердые препаратыГФК, для гель-хроматографии и токсикологических экспериментов - обессоленныерастворы, точный титр которых определяли упариванием аликвотной части раствора ивысушиванием над P2O5 до постоянного веса.ЭлементныйсоставпрепаратовГФКопределялинадвухэлементныханализаторах: модель-1106 фирмы Carlo Erba Strumentazione (Италия) и модели СHN–O–Rapid-Gerдt фирмы Heraeus (ФРГ).Определение молекулярной массы ГФК.

Для определения молярной массы ГФКиспользовали гель TOYOPEARL-50HW(S) (Япония). Для элюирования ГФК использовали0.028 М фосфатный буфер (рН 6.8). В качестве калибровочных веществ использовалиполидекстраны (молекулярная масса 830, 4400, 9900, 21400, 43500, 2000000 дальтон).3.3. Регистрация спектров ЯМРСпектры 13С ЯМР ГФК регистрировали в 10-мм ЯМР-ампуле на приборе VXR-400фирмы Varian при рабочей частоте 100 МГц. Ширина развертки спектра составляла около26000 Гц, время регистрации сигнала спада свободной индукции (ССИ) 0.6 с, интервалмежду импульсами (Td) от 1 до 8 с, при ширине импульса 45°, длительность накопленияспектра 8 - 16 часов. В качестве внутреннего стандарта использовали DSS (натриевуюсоль 3-триметилсилил-1-пропансульфокислоты).Фурье-преобразованиевыполнялосьспредварительнымэкспоненциальнымвзвешиванием сигнала ССИ с константой времени, эквивалентной уширению линий 20Гц.Спектры ПМР регистрировали на спектрометре VXR-400 фирмы Varian на рабочейчастоте 400 MГц.

Ширина развертки спектра составляла около 8000 Гц (от -3 до 17 м.д.),время регистрации сигнала ССИ - 2 с, ширина импульса 17°, число импульсов длянакопления спектра - 512.В качестве внутреннего стандарта использовали сигнал остаточных протоновдейтерорастворителя (ДМСО). При регистрации спектров в D2O в качестве внутреннегостандарта использовали DSS (натриевая соль 3-триметилсилил-1-пропансульфокислоты).Фурье-преобразованиевыполнялиспредварительнымэкспоненциальнымвзвешиванием сигнала ССИ с константой времени, эквивалентной уширению линий 1 Гц.Спектры DEPT и QUAT13С ЯМР растворов ГФК в 0.1М NaOH/D2Oрегистрировали в 5-мм ампулах на приборе фирмы "Bruker" при рабочей частоте 75 МГц вИнституте Экологической Химии (IOC) Центра по Охране Окружающей Среды иЗдоровья Человека (GSF), Мюнхен, ФРГ.

При регистрации спектров использовались118импульсные последовательности DEPT и QUAT, входящие в комплект программногообеспечения фирмы "Bruker". Ширина развертки спектров составляла около 35000 Гц.Отнесение сигналов проводили по химическому сдвигу внутреннего стандарта DSS.Обработку одномерных спектров проводили на персональном компьютере сиспользованием программ NUTS и WINNMR.Двумерные спектры ЯМР регистрировали в 5 мм ампулах на спектрометре фирмы"Bruker" с рабочей частотой 500 МГц для ядер 1H в Институте Экологической Химии(IOC) Центра по Охране Окружающей Среды и Здоровья Человека (GSF), Мюнхен, ФРГ.Регистрация двумерных спектров ЯМР проводилась с использованием стандартныхимпульсных последовательностей COSY, TOCSY, EXSY, и CPMG, входящих в составпакета программного обеспечения фирмы “Bruker”.

Обработку двумерных спектров ЯМРпроводили на рабочей станции “Silicon Graphics” с использованием программыXWINNMR.Приготовление образцов для регистрации спектров 13С ЯМРОбразцы для регистрации спектров ЯМР 13С готовили растворением навески 100 мгтвердого препарата ГФК в 3.5 мл 0.1М NaOH в D2O.Приготовление образцов ГФК для регистрации спектров ПМР.Все работы по подготовке образцов для анализа во избежание попадания следовводы в образец проводились в отсутствие доступа воздуха на вакуумной установке.Осушение препаратов ГФК проводилось в высоком вакууме (<5*10-2) при 45°C в течение6 часов.

Для приготовления образцов использовались 5 мм пирексовые ЯМР-ампулы сподпаянным шлифом. Приборы для осушения и растворения препаратов ГФК показаны нарис. 3.1.Приготовление образцов ГФК для регистрации спектров ПМР в ДМСО-d6Навеску 15 мг ГФК помещали в 5 мм ЯМР-ампулу 5, припаянную к широкойтрубке 4 с перетяжкой и шлифом, предварительно откачанную на вакуумной установке ипрогретую. Затем в трубку помещали разбиваемую ампулу 3 с 0.7 мл ДМСО-d6, после чеготрубку через кран подсоединяли к вакуумной установке .Сушку образца проводили в течение 6 часов при 45оС, после чего кранперекрывали, трубку снимали и встряхивали, разбивая ампулу с ДМСО. Растворительперетекал в ампулу для ЯМР, которую после этого отпаивали.Время растворения различных препаратов ГФК в зависимости от зольностипрепарата составляло от 1 до 48 часов.119Приготовление образцов ГФК для регистрации спектров ПМРв ДМСО-d6 с предварительным дейтерообменомОбразец ГК массой 15 мг помещали в прибор для дейтерообмена 2, предварительновысушенный под вакуумом, туда же помещали разбиваемую ампулу 1 с 0.7 мл ДМСО-d6.Сушку образцов проводили в течение 6 часов при 45оС на вакуумной установке.