Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы, страница 7

Значения рабочихпотенциалов биосенсоров находились в районе 0.00 В. А также позднее данныйпринцип был успешно применен для определения лактата, с использованиемэлектродов,модифицированныхБЛсиммобилизованнымферментомлактатоксидазой [50], схема действия биосенсора приведена на рис. 7.В основе действия биосенсора лежит реакция окисления специфическогосубстрата (лактата) кислородом воздуха в активном центре фермента.

При этомкислород восстанавливается до пероксида водорода, который детектируется наэлектроде, модифицированном БЛ.Рис. 7. Схема действия биосенсора на основе берлинской лазури для определениялактата.В число биосенсоров на основе гексацианоферратов металлов входят такжесенсоры для определения глюкозы [121-123], этанола, D-аланина, оксалата [124] иглутамата, причем БЛ используется в большей части данных аналитическихустройств.Таким образом, берлинскаяэлектрокатализаторомлазурь являетсявосстановленияпероксиданаилучшимводорода,известнымвозможностьпроведения экспериментов при потенциале 0.00 В позволяет избавиться отмешающеговлияниявосстановителей,присутствующихвбиологическихжидкостях.

Стабильность, широкий диапазон определяемых концентраций ивысокая селективность в присутствии кислорода позволяют успешно применятьэлектроды, модифицированные берлинской лазурью, в качестве основы присоздании биосенсоров для анализа биологических объектов.38Глава 4. Иммобилизация ферментов при конструированиибиосенсоров4.1.Методы иммобилизации ферментовФункционированиеэлектрохимическихбиосенсоровосуществляетсяпосредством сопряжения биохимической и электрохимической реакций.

В связи сэтимпомимосозданияконструированииэффективногобиосенсорабиочувствительногоэлементаважнуюнапокрытиярольтрансдьюсераиграетповерхностирабочегоприиммобилизацияэлектрода[125].Иммобилизация – это процесс создания гетерогенных катализаторов путѐмсвязывания ферментов с носителями различной химической природы. Именноиммобилизацияявляетсянаиболеетрудоемкимпроцессомприсозданиибиосенсоров, так как благодаря эффективной иммобилизации фермента наповерхности электрода можно добиться длительной стабильной работы датчика, атак же повышения чувствительности и расширения диапазона определяемыхконцентраций.Среди методов иммобилизации ферментов наибольшее распространениеполучили физическое удерживание (адсорбция или захват в полимерном геле) иковалентное связывание с нерастворимой подложкой.Адсорбция фермента представляет собой наиболее простой способ созданиябиочувствительного слоя, являющийся наименее разрушительным для ферментов.При данном способе иммобилизации глобула фермента удерживается наповерхностиэлектродаспомощьюэлектростатических,водородныхилигидрофобных взаимодействий [126, 127].

Главным недостатком метода адсорбциифермента на поверхности электрода является вымывание фермента в процессереакции с определяемым веществом. Для предотвращения данного явления частоприменяютметод«двойнойиммобилизации»[128]:наповерхностьадсорбированного фермента наносят слой мембраны, выступающей такжебарьером для примесей, влияющих на отклик биосенсора. Однако нередко принанесениидополнительноймембраныповерхадсорбированногосущественно снижается чувствительность биосенсора.фермента39Ковалентная иммобилизация фермента на поверхности электрода позволяетдостичь большей стабильности биочувствительного слоя [129].

Для этогоиспользуются функциональные группы на поверхности глобулы фермента(аминогруппы, карбоксильные, гидроксильные и имидазольные). При этом в ходеиммобилизации не затрагиваются те функциональные группы, которые важны дляпроявления каталитической активности фермента. Поэтому иногда ковалентнуюмодификацию проводят в присутствии субстрата фермента. Чаще всего дляковалентной иммобилизации применяют глутаровый альдегид.Наибольший интерес, с точки зрения сохранения активности фермента,представляетформированиизахватгеляферментаввмембраныферментсодержащейизполимерногополимернойгеля.смеси,Приферментзахватывается в образующийся гелевый носитель. При контроле степени сшивкигеля данный метод может использоваться для любого фермента, поскольку в гелебелковые молекулы удерживаются трехмерной решеткой (как, например, вжелатине), что используют при создании ферментных электродов [97].

Данныйспособ иммобилизации обладает двумя основными преимуществами: есть возможность одновременно включать в гель и соответствующиепереносчики электронов [130, 131]; матрицы могут выполнять роль ионоселективных мембран, то естьучаствовать в формировании отклика биосенсора, или предотвращатьмешающее влияние некоторых частиц [132].4.2.Иммобилизация лактатоксидазыМолекула фермента лактатоксидазы состоит из 4 - 8 субъединиц массой43500 Да [133].

Оптимальными условиями для работы фермента являются рН 6.5 итемпература 25оС. Как известно из литературы, активный центр лактатоксидазысодержит два остатка аргинина Arg181 и Arg268, которые положительно заряжены[134-136]. Эти аргининовые остатки расположены в непосредственной близости кфламинмононуклеотиду и, вероятно, являются частью субстрат-связывающегоучастка фермента.Сохранение длительной активности фермента, иммобилизованного наповерхности электрода, является ключевым фактором при разработке биосенсоров40для возможности их практического применения.

Для стабилизации лактатоксидазына поверхности электрода используют различные стратегии, например, сшивка вполимерную матрицу [38, 59], захват в проводящих и непроводящих полимерах[137, 138], золь-гель метод [50, 56, 139] и гидрогелевые матрицы [140, 141], а такжеиспользование бычьего сывороточного альбумина и ковалентное присоединениефермента к электроду [142, 143].ПрииспользованиивбиосенсорахиммобилизацииЛОДаминопропилтриэтоксисилан с бычьим сывороточным альбуминомвγ-и сшивкойглутаровым альдегидом диапазон определяемых концентраций лактата составил от0.25 до 1.5 мМ [144, 145], время отклика 25 с, спустя 6 ч непрерывных измеренийдатчик теряет 60% от первоначального значения, что объясняется вымываниемфермента.

Также лактатоксидазу иммобилизовали в гидрогеле из альбумина имуцина, а затем с помощью глутарового альдегида фермент был сшит полимернойматрицей [38]. Время отклика такого биосенсора составило 90 с, а диапазонопределяемых содержаний лактата от 0.7 мкМ до 1.5 мМ, при хранении в течение28 дней датчик не теряет активности. В работе варьировали состав альбумина имуцина в иммобилизющей смеси для ЛОД с целью повышения чувствительностибиосенсоров, максимальная чувствительность составила 16.9 мА·М-1·см-2.Вработах[146-148]получилилактатныедатчикисприменениемфенилсилоксана. Другой распространенный способ – послойное нанесение наэлектрод ферментсодержащих растворов и нафионовых мембран (каждый слойсушится перед нанесением следующего) [37]. Но в этом случае увеличиваетсяколичествостадийполучениясенсора,толщинуженаносимыхслоевконтролировать трудно, поэтому такие сенсоры обладают довольно низкойвоспроизводимостью.В работе [148] были предприняты попытки нанесения на платиновыепланарныеэлектродычувствительностьсмеситакихграфитовыхдатчиковвысока,пастносферментом.операционнаяНачальнаястабильностьдостаточно низкая – уже после нескольких измерений отклики начинаютснижаться.Авторы[149]использовалигидроксиэтилцеллюлозу,синтетическийсополимер винилпирролидона и диметиламиноэтилметакрилата, лактитол и41диэтиламиноэтил-декстран для иммобилизации ЛОД.

Датчики с декстраном илактитолом сохраняли около 64% от первоначального отклика после 355 днейхранения при 25ºС, сенсоры с использованием сополимера не теряли в значениичувствительности после 172 дней хранения при 25ºС. В работе [49] ЛОД вмембранах стабилизировали полиэтиленимином и поликарбомаилсульфоновымгидрогелем,ферментсодержащийслойфиксировалидополнительнымводонерастворимым слоем нафиона.Для проведения определения лактата in vivo разработаны микросенсоры,пригодные для имплантации в живые ткани. При получении «иглоподобных»(«needle-type») биосенсоров использовали ковалентную сшивку глутаровымальдегидом, ЛОД стабилизировали дитиотриэтолом и бычьим сыворочнымальбумином, для формирования мембраны внешнего диффузионного контроляиспользовалиполивинихлорид.Припроизводствеимплантируемогобиологического микрочипа [150], предназначенного для совместного определенияглюкозы и лактата, использовали стабилизацию ферментов полиэтиленгликолем,мембрана состояла из метакриловых производных полипиррола.

Этот сенсорсохранял 80% от исходного значения чувствительности после 5 дней непрерывнойработы.В работе [151] в качестве медиатора переноса электронов использовалипроизводные индоанилина, мембрана Nuclepore® наносиласть сверху фермента смедиатором, полученный биосенсор после 19 дней (1710 измерений) сохранял 30%от исходной активности.В статье [46] описан биосенсор, созданный на основе углеродногопланарного электрода, содержащего фталоцианин кобальта в качестве медиатора.В данной работе лактатоксидаза была иммобилизована в мезопористом диоксидекремния, помещенном в матрицу из поливинилового спирта.

Разработанный сенсорсохранял 98% первоначального отклика после 9 мес хранения.Методзоль-гельиммобилизациибылиспользованприразработкелактатного биосенсора в [152]. Лактатоксидаза была иммобилизована в пористуюзоль-гельпленкунаоснове(3-аминопропил)триметоксисилана,2-(3,4-эпоксициклогексил)этил триметоксисилана и полиэтиленгликоля, при этом42биосенсор не терял отклика при хранении в течение 30 дней при +4ºС, пределобнаружения составил 1·10-5 М лактата.Авторы [33] в своей работе сообщают о формировании коллоидныхбиокомпозитов, полученных из лактатоксидазы и наноразмерного фталоцианидакобальта.Полученныекомпозитыбыливпоследствиииспользованыдляиммобилизации лактатоксидазы на поверхности стеклоуглеродного электрода присоздании лактатного биосенсора. Коэффициент чувствительности биосенсора вданном случае достигает 3.98 мА·М-1·см-2, при хранении в течение 1 мес при +4ºСсохраняется 72% от первоначального значения отклика.В лаборатории электрохимических методов химического факультета МГУбыл разработан способ иммобилизации ферментов в пленки нерастворимогополимера на поверхности трансдьюсера, заключающийся в экспонированиифермента в концентрированный органический растворитель, смешивании его систинным раствором полимера, нанесении на поверхность трансдьюсера ивысушивании[153].Данныйспособобладаеттемпреимуществом,чтоформирование мембраны происходит из истинного раствора полимера, чтоприводит не только к повышению однородности ферментсодержащих мембран, нои к увеличению их активности и стабильности.