Диссертация (Фотонно-силовая микроскопия магнитных частиц, клеток крови и волноводных мод фотонных кристаллов), страница 8

Есть работы с применением фемтосекундных лазеров дляуправления положением эритроцитов [66], однако показано, что, например, при средних мощностях более 2,8 мВт лазерного излучения с длительностью импульса 30 фс,частотой повторения 82 МГц и длиной волны 800 нм наблюдаются необратимые изменения формы клетки.3.5.1 Эритроциты: функции и строениеОсновными функциями эритроцитов является перенос кислорода из легких к тканям тела и транспорт углекислого газа в обратном направлении. Это происходит засчет наличия в них гемоглобина, который, соединяясь с кислородом воздуха, содержащемся в легочных альвеолах, образует оксигемоглобин.

Оксигемоглобин, являясьнепрочным соединением гемоглобина с кислородом, легко отдает кислород клеткаморганизма.Эритроциты представляют собой безъядерные клетки, имеющие в покое формудвояковогнутого диска, что обеспечивает избыточную площадь поверхности клетки:поверхность эритроцита больше, чем если бы он имел форму шара того же объема. Это способствует прохождению эритроцитов через узкое сечение капилляров, таккак клетки легко могут изменяют свою форму.

Характерные размеры эритроцитов:7,2–9,2 мкм в длину, 1,7–2,4 мкм в толщину в широкой части на периферии клетки и0,9 мкм в центре. Объем эритроцита составляет 70–100 мкм3 . Содержимое эритроцита— почти насыщенный раствор (около 32% по массе) гемоглобина, обусловливающего красный цвет крови. Важную роль в эритроците выполняет клеточная мембрана,пропускающая газы, ионы и воду. Мембрана эритроцита имеет толщину около 10 нми представляет собой липидный бислой, пронизанный трансмембранными белками,Обзор литературы: применение метода оптического пинцета...40и белковый (спектриновый) скелет.

Трансмембранные белки контактируют с жидкойсредой по обеим сторонам мембраны, образуют каналы, через которые в клетку и изклетки проникают молекулы. Они также выполняют защитную и сигнальную функцию. Спектриновый скелет во многом определяет механические свойства мембраны.Взаимодействие белкового цитоскелета с липидным бислоем мембраны обеспечиваетстабильность структуры эритроцита.Мембрана эритроцитов несет отрицательный поверхностный электрический заряд (ζ-потенциал) [58]. Находясь в электролите, эритроциты притягивают ионы изокружающей среды, таким образом, формируется так называемый двойной электрический слой.

Также известно, что поверхностный заряд рассредоточен по мембранеэритроцита не равномерно, а отдельными очагами [67].3.5.2 Измерения эластичности и деформируемости эритроцитовОдним из традиционных и активно развивающихся направлений в области метода оптического пинцета является изучение и измерение эластичности эритроцитов, а такжедиагностика изменений механических свойств клеток при заболеваниях [68], под действием лекарственных средств [69], в результате длительного хранения крови [63]и даже из-за воздействия гамма-излучения крови, применяемого для исключенияиммунной реакции после переливания крови [70].

Известно, что красные кровяныетельца способны выдерживать огромные напряжения (3 − 5 Н/м2 ) при деформациях,которые они испытывают при прохождении через мелкие сосуды и капилляры. Таккак внутреннее строение эритроцитов представляет собой жидкость, основной вкладв сопротивление нагрузкам вносит мембрана клеток. Поэтому способность эритроцитов проходить сквозь мелкие капилляры напрямую зависит от эластичных свойствмембраны.

Эластичные свойства мембраны можно определить тремя параметрами:коэффициентом растяжения поверхности K, модулем сдвига µ и жесткостью при изгибе B. Однако за эластичность при деформации в сосудах отвечают лишь K и µ,так как жесткость при изгибе имеет порядок от нескольких kB T до десятков kB T ией можно пренебречь [61].В работе [60] методом оптического пинцета был измерен модуль сдвига мембраныэритроцита µ.

К эритроциту в натрий-фосфатном буферном растворе с двух противоположных краев прикреплялись 2 частицы из диоксида кремния размером 2,1 мкм.Обзор литературы: применение метода оптического пинцета...41Затем к частицам с помощью оптического пинцета прикладывали заданную силу F ,направленную на растяжение клетки. При каждом значении силы по микроскопииопределяли изменение диаметра клетки D по сравнению с исходным D0 (рис.

9а).Авторы показали, что при слабых деформациях (F . 15 пН) зависимость диаметраот силы линейная:D = D0 −F.2πµ(45)Аппроксимация экспериментальных (рис. 9б) данных этой зависимостью дала значение µ = 2, 5 ± 0, 4 мкН/м. При сильных деформациях данная зависимость уже неприменима и необходимо использовать методы численного моделирования (некоторые методы описаны в работах [71–75]). Позже той же научной группой была опубликована работа [61], в которой сообщается о том, что были измерены коэффициентрастяжения поверхности K, модуль сдвига µ белкового скелета мембраны эритроцита.

На эритроцит прикреплялись три частицы из оксида кремния (2 мкм в диаметре),каждая из которых захватывалась в оптическую ловушку. После этого в кювету с исследуемыми эритроцитами впрыскивалось вещество, растворяющее липидный бислоймембраны эритроцитов.

В образце оставался только спектриновый скелет мембраны,на котором были прикреплены диэлектрические сферы. Спектриновый скелет растягивался при приложении к диэлектрическим частицам фиксированных калиброванных сил оптических ловушек, и измерялся коэффициент растяжения поверхностиK ≈ 4, 8 ± 2, 7 мкН/м и модуль сдвига µ ≈ 2, 4 ± 0, 7 мкН/м.В статье [64] при изучении эластичности мембраны также прикладывали силучерез прикрепленные микрочастицы, однако авторы предприняли попытку охарактеризовать пластичные свойства мембраны, связанные с возможными изменениямиструктуры спектринового скелета клетки под действием внешней силы.

Мотивацией стало то, что ярко выраженные пластические деформации клеточных мембранэритроцитов сопровождают ряд генетических заболеваний. В экспериментах к предварительно опустошенной от содержимого клетки сферической мембране эритроцитаприлагали периодическую силу путем смещения одной из ловушек с частотой 1–2 Гц.Значение силы определяли по смещению второй частицы из положения равновесия,а удлинение мембраны определяли по расстоянию между частицами. В результате награфике зависимости растяжения мембраны клетки от приложенной силы была полу-Обзор литературы: применение метода оптического пинцета...42чена петля гистерезиса, говорящая о нелинейном отклике изучаемой системы. Такимобразом, можно заключить, что в статье впервые предложено использовать методактивной микрореологии в оптическом пинцете для изучения эластичных свойствмембраны эритроцита, однако авторы сознательно выбрали низкочастотное возмущение, чтобы исключить из рассмотрения любые эффекты, связанные с вязкостьюжидкости и самой мембраны.

Более систематическое исследование отклика эритроцита приведено в работе [76], также рассмотрено влияние истощения запаса аденозинтрифосфата на механические свойства живой клетки. В ней рассмотрены цельныеэритроциты, а диапазон частот, на которых регистрировался их отклик, составлял отдолей до десятков герц. Следует отметить, что для прикрепления диэлектрическихмикрочастиц на мембрану эритроцита необходимо использование различных химических реагентов или инкубирование образцов в течение нескольких часов при низкойтемпературе [74].

Это может нарушать нормальное функционирование и исходныесвойства эритроцита. Поэтому такой способ исследования эластичных и деформационных свойств клеток эритроцитов является возмущающим. Однако даже в такойреализации эксперимента возможно применение оптического пинцета для диагностики заболеваний. Например, в статье [68] показано, что пораженные малярией эритроциты имеют существенно отличающиеся механические свойства по сравнению создоровыми клетками.Динамика восстановления исходной формы эритроцита после снятия напряжениярассматривалась, например, в работе [59]. Эритроцит захватывался одновременно втри оптические ловушки и растягивался, как показано на рис.

10(а). Такой тип деформации схож с деформацией эритроцита в капиллярах. Затем ловушки одновременно выключали и измеряли время восстановления формы клетки(см. рис.10(в)).Было установлено, для молодых клеток время релаксации составляет около 0,16 с,в то время как для старых — 0,35 с. В работе [60] также была рассмотрена динамика восстановления формы эритроцита, чтобы исключить из экспериментов клетки споврежденной мембраной. В данной работе время релаксации предварительно растянутого эритроцита составило τ ≅ 0, 2 c.В работе [77] исследовались механические (вязкость мембраны, сила агрегации) иэлектрические (толщина двойного электрического слоя, ζ-потенциал) свойства эритроцитов с использованием двухлучевого оптического пинцета. Для измерения вязко-Обзор литературы: применение метода оптического пинцета...43Рис. 9: Иллюстрация экспериментальных результатов, представленных в работе [60]: а)эритроцит с двумя частицами, прикрепленными за диаметрально противоположные краяклетки; б) зависимость диаметра эритроцита D от силы F .Рис.

10: Схема захвата эритроцита для определения времени восстановления формы. Захватпроизводился одновременно тремя ловушками. а — невозмущенная форма эритроцита додеформации. б — деформированная клетка. в — процесс восстановления формы эритроцитапосле выключения всех ловушек [59].Обзор литературы: применение метода оптического пинцета...44сти мембраны к одному из эритроцитов, формирующих двойной агрегат, прикреплялась сферическая диэлектрическая частица. Фиксированная в пространстве первая ловушка захватывала прикрепленную к одному из эритроцитов частицу, втораяловушка захватывала край второго эритроцита, после чего передвигалась, разъединяя эритроцитарный агрегат. Измеряя смещение диэлектрической частицы при перемещении второй ловушки (см.

рис. 11a), вычислялась сила оптических ловушек,необходимая для скольжения одного эритроцита по другому, как функция от скорости передвижения второй ловушки (рис. 11в). Так же вычислялась видимая вязкостьмембраны эритроцитов, которая составила 9, 5 · 10−4 пз·см и согласовывалась со значениями, полученными другими методиками [78].3.5.3 Спектроскопия комбинационного рассеяния эритроцитовМетод оптического пинцета применяется в спектроскопия комбинационного рассеяния (КР) света.

В работе [65] этот метод применялся для изучения спектров КРкрасных кровяных телец. Использовалась двухлучевая модификация оптическогопинцета, причем захват клеток проводился с помощью излучения лазерного ИКдиода (830 нм), а резонансное рамановское рассеяние возбуждалось тремя линиямиаргон-криптонового ионного лазера (488, 514,5 и 568,2 нм).

Стоксовы и антистоксовыкомпоненты проявлялись в инфракрасных спектрах поглощения. В работе основноевнимание уделялось концентрации и распределению гемоглобина в эритроците. Былопоказано, что видимое излучение, используемое для возбуждения рамановского рассеяния, вызывает заметные повреждения клеток. Линии 488 и 514,5 нм оказывалибольшее воздействие на захваченные эритроциты, чем линия 568,2 нм. При этом инфракрасное излучение не влияло на эритроциты и не изменяло рамановские спектрырассеяния. Связь спектра комбинационного рассеяния эритроцитов с их механическими свойствами исследуется, например, в работах [79, 80].3.5.4 Агрегация эритроцитовОдним из характерных свойств эритроцитов является их склонность к агрегации.Так, взаимодействуя друг с другом, эритроциты слипаются и образуют так называемые “монетные столбики” (рис.12). В организме непрерывно происходит динамический процесс “агрегация — дезагрегация”, а вязкость крови значительно зависит отОбзор литературы: применение метода оптического пинцета...45Рис.