Заключение организации, где выполнялась диссертация (Флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов)

факультетаФедеральногогосударственногоучреждения высшего образованиябюджетногообразовательного«Московский государственный университетимени М. В. Ломоносова»;по специальности 03.01.02 – биофизика - кандидат физико – математическихнаук Власова Ирина Михайловна, старший преподаватель кафедры общей физикифизическогофакультетаФедеральногогосударственногобюджетногообразовательного учреждения высшего образования «Московский государственныйуниверситет имени М. В. Ломоносова».Необходимость защиты диссертации по двум специальностям обусловленавыполненным диссертантом исследованием свойств флуоресцентных характеристикнаномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов. Вданной работе проведены исследования изменений флуоресцентных свойствкрасителейсемействафлуоресцеина(флуоресцеина,эозина,эритрозинаибенгальского розового) при взаимодействии с бычьим сывороточным альбумином ис сывороточным альбумином человека при различных значениях pH (от 3,5 до 8,0).Метод флуоресцентной спектроскопии позволяет получать и интерпретироватьповедение биологической системы (раствор красителей, раствор красителя сбелком).

Поэтому в изучении свойств флуоресцентных маркеров семействафлуоресцеина невозможно ограничиться изучением какого-то одного аспекта(сугубо оптического или сугубо биофизического), а требуется комплексноеисследование.Всвязисэтимвозникаетнеобходимостьруководствадиссертационной работой как специалистом в области оптики (профессором А.М.Салецким), так и специалистом в области биофизики (старшим преподавателем И.М.Власовой). Порезультатамрассмотрениядиссертации«Флуоресцентныехарактеристики наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточныхальбуминов» принято следующее заключение:Диссертационная работа Кулешовой А.А. «Флуоресцентные характеристикинаномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов»посвящена исследованию методом флуоресцентной спектроскопии флуоресцентныххарактеристиккрасителейсемействафлуоресцеина(флуоресцеина,эозина,эритрозина и бенгальского розового) в растворах, содержащих бычий сывороточныйальбумин и сывороточный альбумин человека, при различных значениях pH.Диссертационная работа посвящена актуальной научной проблеме, имеет высокуютеоретическуюипрактическуюценность,являетсязаконченнымнаучнымисследованием, удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым ВАК РФ кдиссертациям на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук,и соответствует специальностям 01.04.05 – оптика и 03.01.02 – биофизика.Актуальность работы.

Одной из важнейших задач современной физикиявляется изучение биологического материала. С помощью спектроскопическихметодов проводятся активные исследования по реализации быстрого мониторингаизменения состояния клеток, белков, тканей и остальных биологических объектов,осуществляемые при небольших количествах исследуемого образца. Методфлуоресцентных наномаркеров (красителей) с каждым годом всё активнееприменяется в физике, медицине, фармакологии и биологии, так как позволяетполучать информацию об исследуемом материале за минимальные сроки безинвазивного воздействия.

С помощью флуоресцентной спектроскопии исследуют, вчастности, как нативную структуру белков (сывороточных альбуминов), так ипроцессы их обратимой и необратимой денатураций, различные модификации ихструктуры при изменении окружающей внешней среды.Сывороточные альбумины человека (САЧ) и быка (БСА) являются основнымибелками плазмы крови, а именно составляют около 70% от всех белков,содержащихся в плазме крови.

Размеры молекул альбумина невелики, ноконцентрация высока, и он определяет коллоидно-осмотическое давление в плазме.Сывороточные белки (человеческий и бычий) имеют похожую структуру, так какпринадлежат одному гомологическому семейству белков. Одной из основныхфункций данных белков является транспорт физиологических метаболитов,переносимых кровью, чему способствует большая площадь поверхности множествамолекул альбумина.

Сам механизм связывания обширного круга лигандовопределяется наличием у сывороточных альбуминов специфических участков связывающих центров. Есть центры, отвечающие за связывания с ионами металлов,с длинноцепочечными жирными кислотами, с лигандами со свободной SH-группой.Значительный интерес представляют I и II центры (неспецифические лекарственныецентры связывания), присоединяющие малые органические молекулы.Большую роль в изучении физико – химических свойств связывающих центровбелков играет метод флуоресцентных наномаркеров (люминесцентных зондов),чрезвычайно чувствительных к малейшим изменениям окружающей белка среды.Флуоресцентнаяспектроскопияпозволяетанализироватьданныеподобныхтрансформаций, сигналов и изменений. На основе которых появляется возможностьмоделировать как картинку конформационного изменения структуры белков, такнепосредственно и сам механизм взаимодействия сывороточных альбуминов слекарственными препаратами.Цель диссертационной работы состояла в исследовании флуоресцентныххарактеристик наномаркеров семейства флуоресцеина (флуоресцеина, эозина,эритрозина и бенгальского розового) в растворах сывороточных альбуминов(человеческого и бычьего) при различных значениях pH.

В соответствии споставленной целью в работе были изучены следующие основные задачи.1. Измерение спектрально-флуоресцентных характеристик наномаркеров врастворах сывороточных альбуминов при различных концентрациях изначениях pH. Анализ изменений этих характеристик в растворах белков иустановление их природы.2. Проведение анализа процессов тушения флуоресценции наномаркеровфлуоресцеина и его галоген – производных в растворах САЧ и БСА приразных pH и определение параметров этих процессов: константысвязывания с белками и коэффициента кооперативности.3.

Исследование спектров поглощения наномаркеров семейства флуоресцеинав растворах САЧ и БСА при их различных концентрациях и значениях pH.Анализпроцессовмолекулярнойассоциациимолекулкрасителей.Определение эффективности таких процессов, структуры ассоциатов ивлияния белков на процессы комплексообразования.4. ИзмерениеспектровОпределениеполяризованнойпараметровфлуоресценциивращательнойдиффузиинаномаркеров.наномаркеровврастворах САЧ и БСА при варьировании pH.Основные результаты, полученные в работе, состоят в следующем:1.

Методами флуоресцентной спектроскопии исследованы спектральнофлуоресцентныехарактеристикинаномаркеровсемействафлуоресцеина(флуоресцеина (Ф) и его галоген – производных – эритрозина (Эр), эозина (Э),бенгальского розового (БР)) в растворах сывороточных альбуминовдляразличных значений pH. Для всех наномаркеров в растворах белковзафиксировано смещение их спектра флуоресценции в длинноволновуюобласть, обусловленное изменением дипольных моментов флуорофоров при ихвозбуждении.

Показано, что для Эр, Э и Ф дипольный момент уменьшается,для БР – увеличивается.2.Обнаруженосывороточныхтушениеальбуминов.флуоресценцииСнаномаркеровувеличениемзначенияврастворахpHтушениефлуоресценции производных флуоресцеина (Э, Эр, БР) под действием белковуменьшается линейно, с одинаковым коэффициентомнаклона А для БР врастворах обоих белков и с различными для Э и Эр. Причем для Эр он большедля САЧ, в то время как для Э он больше для БСА. Вид зависимости тушенияфлуоресценции Ф от рН среды сильно отличается от зависимостей для егогалоген–производных: имеет немонотонный характер для растворов обоихбелков, что объясняется характером взаимодействия Ф и белков.3. Впервые по тушению флуоресценции наномаркеров семейства флуоресцеинаопределены константы их связывания с сывороточными альбуминами (САЧ иБСА) в диапазоне значений pH (3,5 – 8,0).

Показано, что наличие болееэлектроотрицательных атомов в структурной формуле наномаркера приводит кменее эффективному связыванию с белками в области значений pH отизоэлектрической точки белков (pI САЧ 4,7; pI БСА 4,9) до физиологическогозначения pH (7,4). Получены зависимости констант тушения флуоресцентныхзондов в растворах с БСА или с САЧ от pH. Рассчитаны коэффициентыкооперативности (коэффициенты Хилла) для всех исследуемых растворов,установлено влияние pH среды на параметры тушения флуоресценции.4. Зарегистрировано изменение характеристик поляризованной флуоресценциии параметров вращательной диффузии наномаркеров семейства флуоресцеинав растворах сывороточных альбуминов в широком диапазоне pH (3,5 – 8,0).Показано, что степень анизотропии флуоресценции наномаркеров и время ихвращательной релаксации в растворах белков возрастают, а коэффициентвращательной диффузии наномаркеров в растворах белков уменьшается за счетсвязываниянаномаркеровссывороточнымиальбуминами.Изэкспериментальных данных рассчитаны параметры вращательной диффузиинаномаркеров, характеризующие их связывание с белками ( Dвращ ; ξ; Rэфф ) дляразличныхрН.Видзависимостейдляисследуемыххарактеристикполяризованной флуоресценции различаются для флуоресцеина и его галоген –производных.

Установлено, что при увеличении электроотрицательностирадикалов боковых групп (в порядке флуоресцеин, эритрозин, эозин,бенгальский розовый) значения характеристик r, ξ возрастают, а Dвращуменьшается для 3,5 < pH < 8,0, как в растворах без белков, так и с САЧ и БСА.5. Методом абсорбционной спектроскопии исследованы процессы ассоциациинаномаркеров семейства флуоресцеина в буферных растворах и растворахсывороточных альбуминов (САЧ и БСА). Определены значения степениассоциациимолекулнаномаркеров.Установлено,чтоврастворахсывороточных альбуминов связывание наномаркеров с белком сопровождаетсяуменьшением степени молекулярной ассоциации. При этом чем большезначение электроотрицательности боковых радикалов галоген – производныхфлуоресцеина, тем меньше ассоциатов образуется в белковых растворахкрасителя.6.

Исследованы структуры образующих ассоциатов молекул семействафлуоресцеина в буферных растворах и растворах белков. Показано, что вбуферных растворах с ростом рН для БР, Э и Эр наблюдается увеличения угламежду мономерными молекулами в димере. Для Ф в области pH < 6,0 приувеличении рН наблюдается уменьшениеγ , в то время как в области pH > 6,0увеличение рН приводит к увеличению этого угла. В растворах белковизменения углов между молекулами в димере ∆γ зависят как от концентрациимолекул красителя, так и от рН среды.

Для Э и БР при увеличенииконцентрации красителя в растворе БСА угол между молекулами в димереуменьшается. С уменьшением рН в растворе Э и БР в БСА наблюдаетсяуменьшениеγ . Для Эр зависимость ∆γ ( С, рН ) имеет противоположный видпо сравнению с Э и БР. Причем для Э, БР и Эр зависимости ∆γ ( С ) линейны.В то время как зависимости∆γ ( рН ) для Э и БР линейны, а для Эрнаблюдается минимум при рН = 6,0.Для Ф в растворах БСА зависимости ∆γ ( рН ) и ∆γ ( С ) немонотонные сминимумом при рН = 6,0 и С = 30 мкМ.Аналогичные зависимости для Э, БР и Эр наблюдаются и для растворовданных красителей в САЧ. Значительное отличие в зависимости ∆γ ( рН )наблюдается в растворах Ф в САЧ и БСА.