Диссертация (Флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов), страница 11

Методами флуоресцентной спектроскопии исследованы спектральнофлуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина(флуоресцеина (Ф) и его галоген – производных – эритрозина (Эр), эозина(Э), бенгальского розового (БР)) в растворах сывороточных альбуминов дляразличных значений pH. Для всех наномаркеров в растворах белковзафиксировано смещение их спектра флуоресценции в длинноволновуюобласть, обусловленное изменением дипольных моментов флуорофоров приих возбуждении. Показано, что для Эр, Э и Ф дипольный моментуменьшается, для БР – увеличивается.2.Обнаруженосывороточныхтушениеальбуминов.флуоресценцииСнаномаркеровувеличениемзначенияврастворахpHтушениефлуоресценции производных флуоресцеина (Э, Эр, БР) под действием белковуменьшается линейно, с одинаковым коэффициентом наклона А для БР врастворах обоих белков и с различными для Э и Эр.

Причем для Э он большедля САЧ, в то время как для Эр он больше для БСА. Вид зависимоститушения флуоресценции Ф от рН среды сильно отличается от зависимостейдля его галоген–производных: имеет немонотонный характер для растворовобоих белков, что объясняется характером взаимодействия Ф и белков.3.Впервыепотушениюфлуоресценциинаномаркеровсемействафлуоресцеина определены константы их связывания с сывороточнымиальбуминами (САЧ и БСА) в диапазоне значений pH (3,5 – 8,0).

Показано,что наличие более электроотрицательных атомов в структурной формуленаномаркера приводит к менее эффективному связыванию с белками вобласти значений pH от изоэлектрической точки белков (pI САЧ 4,7; pI БСА4,9) до физиологического значения pH (7,4). Получены зависимости константтушения флуоресцентных зондов в растворах с БСА или с САЧ от pH.Рассчитаны коэффициенты кооперативности (коэффициенты Хилла) для всехисследуемых растворов, установлено влияние pH среды на параметрытушения флуоресценции.984.Зарегистрированоизменениехарактеристикполяризованнойфлуоресценции и параметров вращательной диффузии наномаркеровсемейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов в широкомдиапазоне pH (3,5 – 8,0). Показано, что степень анизотропии флуоресценциинаномаркеров и время их вращательной релаксации в растворах белковвозрастают, а коэффициент вращательной диффузии наномаркеров врастворах белков уменьшается за счет связывания наномаркеров ссывороточными альбуминами.

Из экспериментальных данных рассчитаныпараметры вращательной диффузии наномаркеров, характеризующие ихсвязывание с белками ( Dвращ ; ξ; Rэфф ) для различных рН. Вид зависимостейдляисследуемыххарактеристикполяризованнойфлуоресценцииразличаются для флуоресцеина и его галоген – производных. Установлено,что при увеличении электроотрицательности радикалов боковых групп (впорядке флуоресцеин, эритрозин, эозин, бенгальский розовый) значенияхарактеристик r, ξ возрастают, а Dвращ уменьшается для 3,5 < pH < 8,0, как врастворах без белков, так и с САЧ и БСА.5.Методомабсорбционнойспектроскопииисследованыпроцессыассоциации наномаркеров семейства флуоресцеина в буферных растворах ирастворах сывороточных альбуминов (САЧ и БСА).

Определены значениястепени ассоциации молекул наномаркеров. Установлено, что в растворахсывороточныхальбуминовсвязываниенаномаркеровсбелкомсопровождается уменьшением степени молекулярной ассоциации. При этомчем больше значение электроотрицательности боковых радикалов галоген –производных флуоресцеина, тем меньше ассоциатов образуется в белковыхрастворах красителя.6. Исследованы структуры образующих ассоциатов молекул семействафлуоресцеина в буферных растворах и растворах белков. Показано, что вбуферных растворах с ростом рН для БР, Э и Эр наблюдается увеличенияугла между мономерными молекулами в димере.

Для Ф в области pH < 6,099при увеличении рН наблюдается уменьшениеγ , в то время как в областиpH > 6,0 увеличение рН приводит к увеличению этого угла. В растворахбелков изменения углов между молекулами в димере ∆γ зависят как отконцентрации молекул красителя, так и от рН среды. Для Э и БР приувеличении концентрации красителя в растворе БСА угол между молекуламив димере уменьшается.

С уменьшением рН в растворе Э и БР в БСАнаблюдается уменьшениеγ.Для Эр зависимость∆γ ( С, рН )имеетпротивоположный вид по сравнению с Э и БР. Причем для Э, БР и Эрзависимости ∆γ ( С ) линейны. В то время как зависимости ∆γ ( рН ) для Э иБР линейны, а для Эр наблюдается минимум при рН = 6,0.Для Ф в растворах БСА зависимости ∆γ ( рН ) и ∆γ ( С ) немонотонные сминимумом при рН = 6,0 и С = 30 мкМ.Аналогичные зависимости для Э, БР и Эр наблюдаются и для растворовданных красителей в САЧ. Значительное отличие в зависимости ∆γ ( рН )наблюдается в растворах Ф в САЧ и БСА. Если для Ф в растворах БСА прирН = 6,0 наблюдается минимум в этой зависимости, то для растворов Ф вСАЧ при рН = 6,0 наблюдается максимум.7.

Впервые показано, что наличие сильно электроотрицательных атомовв молекулах галоген–производных флуоресцеина приводит к изменению ихспектрально-флуоресцентных характеристик (зависящих от эффективностисвязывания наномаркеров с альбуминами) и абсорбционных характеристик(обусловленных уменьшением степени ассоциации молекул и изменениемструктуры ассоциатов), к возрастанию степени анизотропии флуоресценции,к увеличению времени вращательной релаксации наномаркеров и куменьшению их коэффициента вращательной диффузии.100СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИA1. Vlasova I.M., Bukharova E.M., Kuleshova A.A., Saletsky A.M. Spectroscopicinvestigations of interaction of fluorescent nanomarkers of fluorescein family withhuman serum albumin at different values of pH// Current Applied Physics.

–2011. – Т. 11. – №. 5.– С. 1126 - 1132.A2. Власова И.М., Кулешова А.А., Салецкий А.М. Флуоресцентныехарактеристики и молекулярная ассоциация наномаркера бенгальскогорозового врастворахсывороточногоальбумина человека//ВестникМосковского Университета. Серия 3. Физика. Астрономия. – 2011. – №. 5.–С.44-48.A3.Vlasova I.M., Kuleshova A.A., Panchishin A.I., Vlasov A.A. Investigation ofinteraction of fluorescent nanomarker Bengal Rose with human serum albumin atvarious values of pH //JournalofMolecularStructure.

– 2012. –Т. 1016.–С. 1.A4. Власова И.М., Кулешова А.А., Власов А.А., Салецкий А.М. Процессымолекулярной ассоциации и флуоресцентные характеристики наномаркеровсемейства флуоресцеина в растворах бычьего сывороточного альбумина//Вестник Московского Университета. Серия 3. Физика. Астрономия.– 2013. –№. 4. –С. 39-44.A5.Vlasova I.M., Kuleshova A.A., Vlasov A.A., Saletsky A.M. Investigation ofbinding of nanomarkers of fluorescein family to bovine serum albumin at variousvalues of pH: Spectroscopic study// Journal of Molecular Structure.

– 2013. –Т.1051.–С. 86-94.A6.Vlasova I.M., Kuleshova A.A., Vlasov A.A., Saletsky A.M. PolarizedFluorescence in investigation of rotational diffusion of the fluorescein familymarkers in bovine serum albumin// Moscow University Physics Bulletin. – 2014. –Т.69.–№.5.–С. 401-405.A7. Власова И. М., Кулешова А.А., Власов А.А., Салецкий А.М.Вращательная диффузия маркеров семейства флуоресцеина в растворахбычьегосывороточногоальбуминаподаннымполяризованной101флуоресценции//Журнал Физической Химии.

– 2015. –Т. 89. – №. 2. –С. 345350.СПИСОК ТЕЗИСОВ КОНФЕРЕНЦИЙB1. Kuleshova A.A., Vlasova I.M. Spectroscopic investigations of characteristicsof fluorescein’snanomarkers in solutions of bovine serum albumin// In WDS’13Proceedings of contributed papers: Part III–Physics(eds. J. Safrankova and J.Pavlu), Prague, Matfyzpress. – 2013. –С. 171-176.B2.БухароваЕ.М.,ВласоваИ.М.,КулешоваА.А.,СалецкийА.М.Определение параметров вращательной диффузии наномаркеров семействафлуоресцеина в растворах сывороточного альбумина человека методомполяризованной флуоресценции. В сборнике тезисов докладов и сообщенийна XVII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярныхсистем-Яльчик-2010», Уфа, ИФМК УНЦ РАН, 2010,стр.

34.B3. Кулешова А.А., Бухарова Е.М., Власова И.М. Вращательная диффузиянаномаркеров семейства флуоресцеина в растворах альбумина человека. Всборнике тезисовмеждународной конференции студентов, аспирантов имолодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов – 2010», секция«Физика»,том 1, физический факультет МГУ, 2010, стр. 224-225.B4. Кулешова А.А., Власова И.М.

Спектроскопические исследованиявзаимодействия флуоресцентного наномаркера бенгальского розового ссывороточным альбумином человека. Материалы XVIII международнойнаучной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов– 2011», секция «Физика»,подсекция«Биофизика», 2011г., стр. 3-4.B5. Власова И.М., Кулешова А.А., Полянский Д.В. Анализ взаимодействиябенгальского розового с сывороточным альбумином человека по спектрамфлуоресценции и поглощения наномаркера. В сборнике тезисов XVIIIВсероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных системЯльчик-2011»; Казань, Казанский федеральный университет, 2011 г., стр. 29.102B6. Кулешова А.А., Полянский Д.В., Власова И.М. Различные способырасчета констант связывания флуоресцентных маркеров с альбуминомчеловекакакпримерымоделированиясвязыванияальбуминомлекарственных препаратов.

В сборнике материалов V Троицкой конференции«Медицинская физика и инновации в медицине», 2012, том 1, стр. 220-222.B7. Власова И.М., Кулешова А.А., Полянский Д.В. Вращательная диффузияфлуоресцентногонаномаркерабенгальскогорозовоговрастворахсывороточного альбумина человека. В сборнике тезисов XIX Всероссийскойконференции«Структураидинамикамолекулярныхсистем-Яльчик-2012»;Москва, ИФХЭ РАН, 2012 г., стр.

37.B8. Кулешова А.А., Полянский Д.В., Власова И.М. Флуоресцентный анализ вопределении констант связывания наномаркеров семейства флуоресцеина ссывороточным альбумином человека. В сборнике трудов VII международнойконференции«Фундаментальныепроблемыоптики-2012»,Санкт-Петербург, НИУ ИТМО, 2012, стр. 501-503.B9.ВласовамолекулярнойИ.М.,КулешоваассоциацииА.А.,ЖерновенковананомаркеровсемействаС.И.Процессыфлуоресцеинаврастворах бычьего сывороточного альбумина.

В сборнике тезисов XXВсероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных системЯльчик-2013»; Йошкар-Ола, ПГТУ, 2013 г., стр. 49.B10. Кулешова А.А., Власова И.М. Флуоресценция и молекулярнаяассоциация наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах бычьегосывороточногоконференцииальбумина.ВсборникетрудовVIIIмеждународноймолодых ученых и специалистов «Оптика - 2013», Санкт-Петербург, НИУ ИТМО, 2013, стр. 379-381.B11. Власова И.М., Кулешова А.А. Взаимодействие наномаркеров семействафлуоресцеина с бычьим сывороточным альбумином по анализу поляризациифлуоресценции наномаркеров.